第五节 神经干细胞的应用

【神经干细胞的生物学特性及潜在作用】

Reynolds等于1992年首次利用神经细胞球形成法，在表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)存在的条件下，持续培养悬浮状态下的神经干细胞(neural stem cells，NSCs)，使其不断增殖，成功地从成年小鼠纹状体分离出了NSCs，打破了神经细胞不能再生的传统理论。1997年Mckay在Science杂志上将NSCs定义为具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞能力，并能自我更新，提供大量脑组织细胞的细胞。NSCs广泛分布于哺乳动物胚胎期大脑皮质、海马、纹状体、嗅球、脑室部位，包括侧脑室、第三脑室和第四脑室、间脑、中脑、小脑、脊髓甚至视网膜。近年来还发现，成年动物室管膜下区(SVZ)、海马齿状回颗粒下区(SGZ)、嗅球、骨髓、纹状体等部位也存在干细胞，并能分离培养得到NSCs。NSCs是具有高度自我更新能力、多潜能分化、低免疫源性、趋化性和迁移功能等特性的原始细胞，正常情况下处于相对静止状态，在有诱导信号存在时可发生增殖、迁移和分化，可在体内和体外无限增殖分化为中枢神经系统各种成熟细胞，使损伤后的脑组织再生，并维持其神经内环境稳态，在细胞替代治疗方面具有极大的应用价值，也是目前临床治疗最有前景的可再生细胞来源。

【神经干细胞的分类】

能分化为神经细胞的干细胞种类较多，目前可用于神经系统疾病细胞移植治疗的干细胞主要有以下3种。

1．胚胎干细胞

胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)是指胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外特殊培养筛选出的细胞。最近，人ESCs体外培养获得成功。ESCs作为一种高度未分化细胞，具有发育全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。其诱导神经细胞产生过程首先是生成神经元和神经胶质细胞前体细胞;再分化为胶质细胞和有功能的神经元。研究者们热衷于诱导ESCs分化为多巴胺神经元的研究，已有报道源于小鼠ESCs的多巴胺神经元植入PD大鼠模型中可存活并发挥功能。虽然ESCs可产生足够数量的多巴胺神经元用于细胞移植治疗，但因伦理问题(自体ESCs移植是不现实的)以及其植入体内后可能产生肿瘤的特性使其临床应用受到很大的限制。

2．骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一群发育早期具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，来源较广泛，取材相对容易，且自体BMSCs移植免疫源性低，可在体外扩增，无需考虑排异及伦理法律问题，已成为现阶段生物医学领域研究的重点。不仅分化为神经细胞，BMSCs植入体内后还可产生大量的神经营养因子和细胞因子，但植入未经基因修饰的BMSCs很难在体内存活较长时间，其营养作用也随之减弱。将经过基因修饰的BMSCs植入PD大鼠模型可分泌左旋多巴和神经营养因子，有效减轻模型动物的PD症状。

3．脐血干细胞

脐血是指胎儿娩出、脐带结扎后断脐或穿刺引流采集到脐带内、胎盘胎儿侧血液，包括单核细胞、间充质干细胞，并混杂多能干细胞。新生儿脐血中含丰富的干细胞，比外周血和骨髓中含量均高，不仅含有丰富的造血干细胞，而且还含有大量的多潜能干细胞，可以向内皮、血管以及神经等组织分化。脐血干细胞用于细胞替代治疗具有来源丰富、取材方便、低免疫源性及细胞纯度高的特点，且无需考虑伦理法律束缚及排异问题，可在体外迅速扩增，并同样具有强大的自我更新和多向分化潜能等诸多优势。

【细胞治疗的方法及细胞移植的途径】

1．诱导内源性NSCs激活、迁移并增殖分化，修复损伤的神经组织。胚胎期的NSCs起源于神经管上皮并迁移分化为大脑皮质的锥体细胞和中间神经元，出生前大多数神经前体细胞的迁移就已结束。成年哺乳动物生理状态下中枢NSCs的分化迁移主要发生在大脑的SVZ、SGZ以及脊髓的室管膜区和白质。动物实验表明，脑缺血损伤后SGZ内源性NSCs加速分化为神经元，于10天左右达到高峰，并且迁移到达海马的颗粒细胞层。SVZ中的NSCs加速增殖，亦于10天左右达到高峰，迁移到达损伤病灶，替换变性坏死的神经元。但内源性再生修复作用有限，因为再生过程中只有不到50%的神经元能够迁移分化成熟并在损伤部位成功建立突触联系。内源性NSCs再生迁移分化过程并未充分激活或被周围环境抑制。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在化疗引起的粒细胞减少症中已被广泛使用，研究表明，G-CSF具有神经保护和神经再生作用。在模型动物大脑中动脉梗死的急性期、亚急性期及慢性恢复期给予G-CSF均能动员内源性干细胞/祖细胞的增殖分化。G-CSF直接激活脑血管内皮细胞和内皮祖细胞迁移到缺血边界区促进血管再生。在慢性期还可以提高骨髓来源的内皮细胞数量，因此G-CSF治疗脑梗死可以有较长的时间窗。

2．将NSCs在体外大量扩增后，直接移植到病损部位或在体外将之定向分化为所需的特定细胞后移植。已报道的用于NSCs移植的途径主要有3种。①经局部病变部位注射途径;②经血液循环的静脉注射途径;③经脑脊液循环的途径：即脑室系统以及腰椎穿刺蛛网膜下腔注射的方式。目前报道的脑脊液途径移植细胞的方法有侧脑室注射、第四脑室注射、脑池注射和蛛网膜下腔注射4种方式。动物实验中较多应用侧脑室和第四脑室注射的方式，相比之下蛛网膜下腔注射的方式由于损伤小、操作简单，可以进行多次注射而且费用少，易于临床应用。但哪种移植途径最佳，目前还没有系统的研究和比较。经静脉注射和蛛网膜下腔注射的方式是简便、易行、损伤轻微、费用少的治疗方式，但前者存在植入细胞不易通过血-脑脊液屏障的问题，因此蛛网膜下腔注射的方式更便于临床推广应用。

3．将外源性基因导入NSCs，通过外源基因的表达传递营养因子、生长因子以阻止神经细胞变性坏死，起到神经保护作用或释放并补充所缺失的神经递质以达到治疗目的。基因和干细胞的联合应用弥补了单纯基因治疗和干细胞治疗的不足，开创了新的治疗手段。在体外将治疗基因整合到各种不同的干细胞中，然后通过立体定向的方法将这些干细胞注射入宿主脑组织转染基因。这种治疗手段的优势体现在以下几个方面。①干细胞在体外的基因操作可以将外源性基因合并到宿主的基因组中，却避免了宿主细胞和病毒载体的直接接触，后者可以导致各种相应的副作用。②干细胞或祖细胞是利用反转录病毒进行基因合并的理想受体细胞，因为其具有高度增殖能力。有研究表明移植的NSCs可以在缺血脑组织中存活并分化数月而长期表达治疗基因。③对于一些外周器官的疾病例如心脏、肝、骨或造血系统，治疗基因很容易输送到损伤区域，然而对于脑部疾病却很困难。研究表明，无论是内生的或移植的干细胞或祖细胞都可以通过循环系统或病灶周围的炎症趋化因子的相互作用到达损伤区域。这样，通过系统地管理基因修饰的干细胞就可输送治疗基因到达损伤区域。④应用基因修饰的干细胞可以将二者的作用协同起来，携带治疗基因不仅对宿主细胞有利，对植入的干细胞亦是有利的。例如，很多植入缺血脑组织的干细胞在缺氧环境下数天或数周就面临凋亡，然而植入过度表达血管内皮生长因子(VEGF)的NSCs到脑出血动物模型2～8周后，植入细胞数量达到2～3倍的增殖。考虑到过度表达VEGF会引起严重的副作用例如未损伤脑组织的水肿，近年来研究出基于缺血诱导的VEGF基因表达的质粒。体外研究表明这种基因修饰的NSCs在缺氧条件下显著提高了VEGF的表达，当植入到脊髓损伤动物模型后凋亡细胞数量显著减少。

当转染人脑源性神经营养因子(BDNF)的鼠胚胎源性NSCs植入短暂性的大脑中动脉闭塞(MCAO)动物模型的缺血半暗带脑组织，植入后12周与生理盐水组及非转染NSCs组相比，NSS评分显著改善，说明神经功能恢复显著。此外随访还发现植入的NSCs可以分化为成熟的神经元。表明转染BDNF基因可以提高NSCs的治疗效果且不影响其在宿主脑组织中的存活和分化。移植BDNF基因修饰的人间质干细胞(MSCs)也可以减少缺血损伤，缺血边缘细胞凋亡显著减少和显著的功能恢复。神经营养因子-3(NT-3)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰的NSCs或MSCs植入缺血动物模型均取得了良好疗效。在动物模型中开展的各种不同类型的基因修饰的干细胞治疗结果也表明有支持血管发生及神经保护的作用。包括VEGF、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胎盘生长因子(PIGF)和干细胞生长因子(HGF)等。VEGF因其在胚胎及成年的血管发生中起着重要作用更受到研究者的青睐，研究发现其在卒中后的内源性神经再生中起着神经保护作用。将人VEGF基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)植入MCAO大鼠模型，发现植入点周围VEGF表达增加，与生理盐水组及未修饰BMSCs组相比，有显著的功能改善及梗死体积的减少作用。植入12天后缺血半暗带皮质有微血管形成。

【移植NSCs的作用机制】

1．神经元替代

神经组织损伤后释放各种趋化因子，加上缺氧缺血时，损伤的血管内皮细胞、胶质细胞使局部通透性增加，在多种黏附分子作用下，NSCs植入后可透过血-脑脊液屏障，高浓度聚集于损伤部位。在局部微环境作用下整合至神经系统分化并产生新的神经元，代替有缺陷或死亡的神经元，与周围的神经系统一起重建神经元回路，恢复部分神经功能。

2．轴突再生

中枢神经系统损伤后，内源性NSCs由静息状态转为活化状态，增强神经突触之间联系，建立新的神经环路和突触连接，并分化为各种成熟的神经细胞，迁移至缺氧缺血处，替代损伤区域细胞，修复神经损伤。移植物一方面可以提供生长基质，另一方面可以募集内源性生长因子促进细胞，如施万细胞，进入损伤部位促进轴突再生。

3．髓鞘再生

植入的NSCs分化产生胶质细胞，促进新生的神经纤维和残存脱髓鞘的神经纤维髓鞘化，以恢复神经结构的完整性。

4．分泌多种神经营养因子

NSCs能分泌多种神经营养因子，如BDNF、GDNF、NT-3和NGF等，在神经组织再生修复过程中发挥重要作用。其可能的作用机制：活化静息突触，促进神经递质释放，促进内源性NSCs增殖分化、迁移至损伤区域，促进VEGF释放，诱导微血管生成，使血管密度增加，改善损伤区血液循环;促进宿主神经轴突生长，使髓鞘再生。

【干细胞移植在临床中的应用】

虽然NSCs治疗神经系统疾病在动物实验中取得了可喜的成就，但目前应用于临床的研究很少，由于国情不同国内临床开展比较活跃，仅限于小规模的临床试验，缺乏大样本的研究。

1．NSCs移植治疗神经变性疾病

以帕金森病(Parkinson′s disease，PD)为代表的中枢神经系统退行性疾病是NSCs治疗的热点之一。PD是因中脑黑质-纹状体内多巴胺神经元变性导致多巴胺递质分泌减少引起的疾病。19世纪80年代研究者首次将来自胎脑干细胞诱导分化成的多巴胺细胞植入PD患者纹状体内，但研究结果却不尽如人意，有阴性的结果，也有阳性结果的报道，认为移植术后可延长生存期。也有研究表明只有年轻患者能够获益，获益者仍有半数以上会出现运动障碍。即使如此，NSCs移植作为一种新的治疗手段还是给PD的治疗带来了希望，但是源自胚胎的多巴胺前体细胞数量有限，远远满足不了临床治疗的需要，迫切需要能产生大量多巴胺前体细胞的干细胞来源。自体BMSCs具有免疫源性低，可在体外扩增，无需考虑排异及伦理法律问题的优点，研究者们将PD患者BMSCs体外扩增后植入脑内并随访36个月，这项临床试验取得了令人振奋的结果，PD患者的临床症状得到了部分改善，没有肿瘤形成及其他移植带来的副作用。

国内张晓英取12周人胚胎脑组织的NSCs体外培养扩增，计数5×106～1×107制作成混悬液4～6m l，通过腰椎穿刺、颈动脉注射途径植入30例PD患者体内，1次/周，共3次。发现源自人胚胎脑组织的NSCs可在体外稳定扩增，并且具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。通过随访发现NSCs移植能有效控制PD病理进程、改善患者的神经功能，且无明显并发症。田增民等将5～11周人胚胎的前脑细胞在体外稳定扩增，并向多巴胺神经元转化，通过立体定向手术将其植入PD患者的纹状体，共治疗50例PD患者。结果人胚胎前脑细胞可在体外扩增并维持不分化状态1年以上，扩增的细胞可达原始细胞数量的1×107倍，并可向多巴胺神经元转化;PD患者临床移植手术后随访8～30个月(平均24个月)，有效率为92%，未见明显的免疫排斥反应。王维铭等利用自体骨髓基质细胞蛛网膜下腔移植治疗帕金森叠加综合征患者，随访1年，7例患者的共济运动、言语及吞咽功能、日常生活能力得到改善。自体BMSCs移植治疗PD的临床研究尚处于起步阶段，在广泛用于临床之前需要大量的临床研究资料来证实其有效性和安全性。

2．NSCs移植治疗脑卒中

2005年Bang等采用自体BMSCs静脉注射的方式治疗了5例有严重神经功能缺损的脑梗死患者，病程为5～9周，移植后患者神经功能有明显恢复，认为自体BMSCs移植是安全易行的治疗脑梗死的方法。Honmou等用自体BMSCs静脉植入治疗了12例卒中后30～133天的患者取得疗效。Lee等2010年用同样方法治疗了52例脑梗死患者，认为静脉移植自体BMSCs是安全有效的。2005年，俄罗斯和韩国也分别发表了BMSCs移植治疗缺血性脑血管病的临床报告。前者有10例脑卒中患者接受BMSCs移植，移植部位为蛛网膜下腔，移植6个月时的神经功能恢复显著优于未移植的对照组;后者有5例经静脉移植1×108个自体BMSCs，1年后评定神经修复的Barthel指数较对照组显著改善，MRI随访显示尽管脑梗死体积无显著缩小，但继发性脑萎缩和脑室扩张程度轻于对照组。值得注意的是所有关于自体BMSCs临床移植治疗脑血管病的报道均缺乏有说服力的显著统计学差异。自体BMSCs移植在临床应用中受到很多参数的影响。包括供体细胞方面的因素(安全性、自体抑或异体、体外细胞扩增过程中是否受到污染)、患者方面的因素(年龄、卒中的类型)、治疗因素(移植方式)以及疗效评估方式的影响。

国内杨清成等于鞘内注射NSCs治疗脑卒中(脑出血11例，脑缺血15例)，其中3例急性脑出血患者行微创血肿穿刺术，通过引流管将细胞悬液注射到脑损伤处，其余病例均采用将细胞悬液注入蛛网膜下腔的方法。移植前及移植后6个月采用欧洲卒中量表(ESS)评分和生活能力量表(Barthel指数)评分评价疗效。23例患者中19例有效，4例无效，移植后ESS及BI评分显著增高，3例行微创血肿穿刺术急性脑出血患者均恢复良好，生活可基本自理。细胞移植的不良反应轻微，其中4例患者移植后24小时内有一过性发热，2例有轻微头痛。说明蛛网膜下腔移植NSCs可以改善脑卒中患者的临床症状，提高其生活质量。张儒有等利用取自流产胎儿的脑组织体外培养诱导分化为NSCs，然后经腰椎穿刺行蛛网膜下腔植入NSCs治疗50例末次发病至接受细胞移植时间平均为3.4年的脑卒中患者。其中基底节病变39例，脑干病变3例，其他部位(丘脑、大脑半球)8例，累积多部位的病变6例，1次/周，共计3次。采用美国功能独立性评测评分对患者术前，术后6个月进行评定。主要评价6个方面的能力：生活自理能力、括约肌控制能力、活动能力、行动能力、理解交流能力、社会认识能力。结果所有脑卒中患者干细胞移植后6个月功能独立性评分显著高于移植前。孟宪国等采用自体BMSCs移植治疗脑梗死患者30例，治疗后4周、12周、6个月患者Fugl-Meyer运动功能评分、功能独立性评定量表评分均显著改善，无特殊不良反应。

3．基因修饰后的干细胞治疗

虽然动物实验取得了一些可喜的成就，但目前为止尚没有基因修饰的干细胞临床应用的研究报道。究其原因主要有以下几点。①治疗时间的选择：在动物实验中，外源基因一般在脑缺血前或缺血发生后就被立即输送到缺血部位。而在临床上具有可操作性的干细胞治疗以自体干细胞居多，体外的分离、扩增及基因转染势必使治疗时间大大延迟，是否有效还有待于进一步的研究以证实。②动物实验基本都采用了年轻的动物，而缺血性脑血管病好发于60岁以上人群。众所周知，年轻和年长动物的脑结构和功能有显著差异，因此，还需要对年长动物的实验来提供证据。③外源基因侵入宿主体内的安全性尚待进一步考证。在治疗获益的同时，有可能因为携带了突变的外源基因的整合细胞导致恶性转变或细胞功能障碍。有些非病毒载体可用于干细胞的基因治疗，但其安全性及有效性尚待研究。

【NSCs的研究展望】

虽然动物实验可以观察到NSCs植入脑内后可以和宿主整合有突触样结构建立，但还没有体内试验能确切证实整合后的细胞有接受电刺激并且能产生动作电位的功能。所以最终NSCs移植主要是通过分泌神经营养因子，增加有利于受损的脑神经细胞恢复的蛋白表达起作用，还是以其替代作用起主要作用，尚不肯定。NSCs研究已在医学领域中呈现出诱人的光辉前景，其临床应用具有巨大的潜力，为目前一些难以根治的神经系统疾病带来新的希望。NSCs移植为中枢神经系统损伤和相关疾病的细胞替代修复及基因转移治疗带来了新的途径，但NSCs的研究中仍有许多问题亟待解决。例如：成人NSCs的确切定位和功能，NSCs增殖、迁移和分化调控机制，NSCs定向诱导分化的诱导因子及其作用机制，分化细胞鉴定及功能检测。NSCs的应用研究及相关技术的发展目前受到干细胞来源的影响很大。因为大部分NSCs由胚胎干细胞培养分化而来。胚胎干细胞移植的安全性、伦理上的争议亦是制约其临床应用的问题。这些问题的解决将推动NSCs更加安全有效地应用于临床。

（潘凤华 丁新生）

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