第四节 基因治疗

一、概述

随着生命科学与技术的飞速发展以及人类对疾病认识的不断深入，越来越多的证据表明，许多疾病都与基因的结构或功能改变有关，因而，萌生了从基因水平治疗疾病的想法。基因治疗的概念最早在1972年由Friedmann和Roblin提出。基因治疗能从根本上治愈一些现有的常规疗法所不能奏效的疾病，而且在疾病的预防方面也能发挥重要作用。

【定义】

基因治疗是基于修复或修饰细胞遗传物质和基因编辑等技术来干预疾病的发生、发展和进程。细胞可以体外修饰，随后再注入患者体内或将基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞内发生遗传学改变，从而替代或纠正人自身基因结构或功能上的错乱、杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等，达到预防、治疗、治愈、诊断或缓解人类疾病的作用。

【基因治疗技术】

基因置换：用正常的基因原位替换致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常。基因置换是最理想的基因治疗方法，但目前的技术水平尚难达到。

基因修复：纠正致病基因的异常部分，正常部分保留，最终使致病基因完全恢复。

基因修饰又称基因增补：将目的基因导入病变细胞或其他细胞，表达产物能加强或纠正缺陷细胞的功能。这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在。目前的基因治疗多采用这种方式。

基因失活：利用反义技术特异地封闭基因表达特性，抑制有害基因的表达，达到治疗疾病的目的。如利用反义RNA、核酶或核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿瘤细胞耐药基因的表达，增加化疗效果。

免疫调节：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入患者体内，改变免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。例如将白介素-2(IL-2)导入肿瘤患者体内，提高IL-2的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤的目的。

【基因编辑】

所谓基因编辑，是指能够让人类对目标基因进行“剪辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等的一种技术。

【基因编辑机制】

目的基因DNA双链断裂(DSBs)可以启动内源性修复机制。DNA链断裂主要有两种修复途径：同源直接修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)，见彩图1-4-1。同源重组修复可通过提供外源性DNA模板插入特异序列，包括产生点突变、加入报告基因、插入标记或进行基因修正等。而非同源末端连接修复则可以通过产生插入或缺失突变，从而引起移码突变或产生提前终止密码等。

【基因编辑技术】

基因编辑技术是一把人类剪切基因的“剪刀”。基因编辑技术始于20世纪80年代建立的基因打靶技术。2000年后，相继出现锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFNs)，转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)技术，可以实现基因组上的高效率定向剪切;2012年以后，第三代基因编辑技术CRISPR-Cas9出现，这一新技术精度高、成本低、操作简单，因此全球掀起基因编辑的研究热潮。

CRISPR/Cas9是一种RNA介导的DNA内切酶，通过一个与目标序列互补的单引导RNA(single guide RNA，sgRNA)引导定位到基因组的与一个以NGG或NAG形式的PAM序列相邻的目标序列上。CRISPR/Cas9在与目标序列结合后，在特定基因组区域产生双链断裂，再通过同源重组或非同源末端连接修复机制引入突变或新的基因，就可达到特异性基因编辑的目的。据一项最新研究报道，研究人员已经创造出了一种更有效、更可控的CRISPR基因编辑系统sOPTiKO，这个系统可以在机体任何细胞中同时进行多个基因的敲除或沉默。

CRISPR/Cas9和神经元：虽然CRISPR技术功能强大，但在神经细胞中其功能却受到了极大的限制。在大脑发育的同时，神经元不再分裂，大多数神经元通过DNA的非同源性末端连接进行自我修复。这种情况下，研究人员只能将外源基因插入神经元基因一端。最近，MPFI的Takayasu Mikuni、Jun Nishiyama和Yasuda博士已经成功实现利用CRISPR/Cas9系统建造一个更快速、可伸缩且高分辨率的神经元DNA编辑技术“SLENDR(ingle-cell labeling of endogenous proteins by CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair)”，通过这一技术的应用，研究人员将荧光蛋白编码基因插入神经元中目的蛋白的编码基因中，进而完成了对以往难以定位大脑神经元蛋白的准确定位。Yasuda等的成功是CRISPR技术进行神经元编辑的开始。

【基因导入系统】

外源基因自己不能主动进入细胞，欲进入细胞内必须借助一定的技术方法。通常把基因治疗中将治疗基因导入细胞内的运载工具称作基因转移系统或载体。载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。腺病毒、逆转录病毒和裸质粒/DNA是最常用的基因转移载体。基因导入方法有两种：基因工程细胞置入法和基因直接导入法，见彩图1-4-2。

基因工程细胞置入法(in vitro)：从患者体内取出有基因缺陷的细胞进行培养，利用基因转移进行遗传修正，然后将修正后的细胞进行选择和培养，通过移植的方法再转入患者体内。临床实际应用存在一定困难。

基因直接导入法(in vivo)：将具有治疗功能的基因直接导入患者的靶细胞中，临床应用方便。

二、基因治疗在神经系统疾病中的应用

神经系统是继癌症、心脏病和感染后，第四大最常见的基因靶向治疗领域。迄今已经有48个在大脑和神经系统中进行基因或细胞替代的临床试验。基因治疗可能是神经变性病的有效治疗方法，目前已开展了一些神经变性病基因治疗的临床试验(表1-4-1)。

【海绵状脑白质营养不良的基因治疗】

海绵状脑白质营养不良(Canavan disease，CD)的基因治疗是基因治疗用于神经变性病的第一个临床试验，具有历史意义。

1996年，两例新西兰海绵状脑白质营养不良儿童首次接受载体携带天冬氨酸酰基转移酶基因[a non-viral lipid-entrapped，polycation-condensed deliverysystem(LPD)，in conjunction with adenoassociated virus(AAV)-based plasmids containing recombinantaspartoacylase(ASPA)，LPD/pAAVaspa]经侧脑室直接注射，结果显示，LPD/pAAVaspa耐受性好，可引起生化、影像及临床改变。

【帕金森病的基因治疗】

帕金森病(Parkinson's disease，PD)的基因治疗是通过载体携带基因物质，促进多巴胺神经元释放左旋多巴，改善PD患者的临床症状。一些临床试验已得出初步结论，即通过对脑部特定区域提供靶向基因治疗，对PD患者有效。PD的基因治疗已成为全球研究的热点。

1．目的基因的选择

（1）与多巴胺合成相关的基因：

酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)基因、GTP环水解酶1(GTP cyclohydrolase 1，GCH 1)基因、芳香左旋氨基酸脱羧酶(aromatic L-amino acid decarboxylase，AADC)基因等。

（2）对多巴胺神经元起保护作用的基因：

胶质细胞源性神经营养因子(glial cel lline-derived neurotrophic factor，GDNF)基因、核受体相关蛋白1(nuclear receptor-related protein 1，NURR1)基因、神经营养因子(neurturin，NTN)基因等。

（3）其他：

研究发现，除了参与多巴胺神经元合成和保护多巴胺神经元的基因外，RNA等分子在PD治疗中的作用也逐渐被人们所认识。目前，miRNA和RNA干扰(RNA interference，RNAi)在PD治疗中的作用引起人们的关注。

2．病毒载体的选择

腺病毒相关病毒(AAV)载体和慢病毒载体是唯一已应用于中枢神经系统临床基因治疗试验的载体，也是PD基因治疗最常用的载体。

PD的基因治疗策略分为下列两类：①通过向纹状体内导入多巴胺合成酶基因从而恢复纹状体多巴胺合成量以缓解帕金森病运动症状;②通过向局部细胞注入神经营养因子(neuturin)来保护和修复已损伤的多巴胺神经元。

迄今为止，已报道5个PD基因治疗的临床试验(表1-4-2)，均使用慢病毒或AAV为载体。

3．AAV载体携带谷氨酸脱羧酶基因

在PD患者中，黑质纹状体多巴胺神经元的减少导致下游基底节区神经递质减少，包括进入丘脑底核的GABA减少，因此，提高丘脑底核中的GABA可以改善帕金森病患者的症状。GAD基因是GABA合成的限速酶，AAV载体携带GAD基因的治疗目的是通过调控丘脑底核的代谢率，释放更多的GABA，从而改善帕金森病患者的运动症状。过去的10年间，进行了通过提高丘脑底核中GABA含量的基因治疗的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验。其方法是使用AAV载体携带GAD基因。

AAV2-GAD的Ⅰ期临床试验在12例中晚期PD患者中进行，评估了AAV2-GAD基因治疗的安全性和耐受性。试验组为12例已经出现明显的左旋多巴运动并发症，年龄25～70岁，病情逐渐进展，H&Y评分≥3分，不能耐受药物治疗，准备行DBS治疗的PD患者。对所有患者单侧丘脑底核注射1～3单位AAV2-GAD，随访12个月未发现治疗相关的不良反应，也不存在相关的免疫反应。在AAV2-GAD治疗的第3、6、9、12个月，进行UPDRS-Ⅲ运动评分，与治疗前相比，治疗后运动功能明显改善。另外，PET检查发现治疗侧苍白球和丘脑部位代谢增高，进一步提供了这种基因治疗有效的客观证据。AAV2-GAD的Ⅰ期临床试验得出的结论是AAV2-GAD治疗PD是安全、可靠的。

AAV2-GAD的Ⅱ期临床试验采用随机、双盲、对照的方法，使用高剂量的AAV2-GAD(1×1012μg/m l)治疗PD患者。共44例病情逐渐进展的PD患者入组，随机分配2l例进入AAV2-GAD组，其余23例进入安慰剂组。AAV2-GAD组双侧丘脑底核注入高剂量AAV2-GAD，安慰剂组注入无菌盐水。所有患者在临床观察期间未发现与操作及基因治疗相关不良反应。观察6个月后发现，AAV2-GAD组与安慰剂组的UPDRS运动评分均有改善(分别为23%，13%)，12个月后AAV2-GAD治疗组的治疗效果明显优于安慰剂组。

4．AAV载体携带芳香族左旋氨基酸脱羧酶基因

随着时间的推移，左旋多巴治疗PD患者的疗效会减退，是因为大脑也开始失去AADC。事实上，PD基因治疗的概念可以追溯到1986年，当时加州大学Krystof Bankiewicz首次确定左旋多巴停止工作的原因是AADC太少，他认为基因治疗可能是一种解决方法。

AADC是一种能促进左旋多巴转化成多巴胺的酶，通过提高左旋多巴转化为多巴胺的效率来进行多巴胺替代治疗。在PD病情逐渐进展时，黑质纹状体的AADC活性随着神经元的减少而降低，AADC活性限制左旋多巴的转化水平，导致多巴胺生成减少。把携带有AADC活性的基因注入壳核，能提高多巴胺的合成和提高多巴胺治疗的有效性，更重要的是，在减少左旋多巴使用剂量的同时，也会减少左旋多巴产生的不良反应。

使用AAV2载体携带AADC基因治疗PD的早期临床试验已经完成，结果证实，使用AAVAADC治疗PD是令人满意和有效的。向10例PD患者双侧壳核后部注入不同剂量的AAV2-AADC，同时口服左旋多巴治疗，随访发现，6个月后UPDRS运动评分“开-关”现象改善30%，PET检查发现纹状体中AADC活性增强，证明临床症状改善与纹状体中AADC活性提高相关。提示使用AAV-AADC可以提高内源性多巴胺神经元的功能。

试验中所有高剂量AAV-AADC组患者和3例AAV-AADC低剂量组患者，服用左旋多巴缓解症状的有效剂量明显减少。提示AAV2载体携带AADC基因治疗可增加口服左旋多巴的有效性。

5．ProSavin

以慢病毒为载体同时携带AADC、TH、GCH 3个基因称为ProSavin。同时携带3个基因治疗PD，既可以恢复AADC活性，又能增加内源性多巴胺神经元和非多巴胺神经元的左旋多巴含量。ProSavin首次使用慢病毒载体，成功应用于人类神经系统疾病的治疗，并且不依赖于多巴胺神经元的存活，而是将PD患者的纹状体神经元转变为具有合成多巴胺功能的神经元。

为了证实ProSavin的长期安全性和耐受性，对15例48～65岁、病程至少5年、“关期”时的H&Y分级≥3和UPDRS-Ⅲ运动评分在20～60分、满足外科干预治疗帕金森病(CAPSIT-PD)标准的PD患者双侧壳核注入ProSavin，试验结果令人满意：在随访的1年中，所有患者(3例为低剂量1.9×107转导单位、6例为中等剂量4×107转导单位、6例为高剂量1×108转导单位)共报告54例次不良反应(51例轻度，3例中度)，主要是药物导致的共济失调和“开-关”现象，没有报告严重的基因治疗和外科注射的副作用。治疗6、12个月所有患者的平均UPDRS-Ⅲ运动评分较治疗前(38分)明显改善(分别为26分、27分)，同时发现使用高剂量的ProSavin对UPDRS-Ⅲ运动功能改善更明显，能最大限度地减少对左旋多巴的依赖。ProSavin治疗PD的长期随访(36个月)，评估UPDRS-Ⅲ运动功能的临床研究正在进行中。

6．AAV载体携带胶质细胞源性神经营养因子基因

动物实验中，直接向纹状体注入GNDF基因后，注射部位多巴胺神经元轴突生长增强，黑质纹状体细胞的凋亡减缓，证明该方法安全、有效。但临床试验中直接注射的方法基本无效。因此，几个临床前期试验使用病毒载体携带GNDF基因代替GNDF基因直接注射，进行疗效观察。

选择腺病毒载体、慢病毒载体，以腺病毒为基础的载体携带GNDF基因转入动物纹状体细胞内，结果证实载体携带的GNDF基因能有效修复黑质纹状体功能及减轻相关的运动障碍。

更广泛的GNDF基因治疗PD的研究是使用Neurturin基因。向灵长类动物和啮齿类动物纹状体内注入2个单位CERE-120，研究结果证实，CERE-120治疗PD安全、有效。随后进行的临床试验中，对12例PD患者给予Neurturin基因治疗，12个月随访发现其UPDRS运动评分改善36%。尽管PET检查未发现多巴胺神经元变化，但试验结果还是证实Neurturin基因治疗是安全有效的，未发现基因治疗的不良反应。

随后开展的58例双盲、随机、安慰剂对照的临床研究中，PD患者在接受NTN基因治疗12个月后随访未发现UPDRS运动评分明显改善，但其中有19例患者在治疗18个月后UPDRS运动评分明显改善，提示使用Neurturin基因的长期效果好。

第二项关于Neurturin基因治疗PD的试验是向壳核和黑质致密部注入更高剂量的Neurturin基因，临床随访3年观察其有效性和安全性。试验第一阶段，向6例患者壳核和黑质致密部注射CERE-120，随访2年，没有发现严重的不良反应，结果显示“关期”UPDRS运动评分在随访12个月和24个月明显改善。试验第二阶段共有51例中度进展的、常规药物治疗不能达到满意效果的PD患者入组，在美国11个医学研究中心进行，结果显示，使用CERE-120治疗安全、耐受性好。但令人失望的是，未发现CERE-120治疗的有效性，尽管在次要结果中有ADL评分明显改善，但在主要终点上UPDRS运动评分未见改善。

【肌萎缩侧索硬化的基因治疗】

家族性肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)的基因治疗可以针对某一特定致病基因，改变受累基因的表达被证实是有效的;对于散发型ALS，可通过给予神经营养因子保护神经元。

ALS基因治疗的临床试验

13%的家族性ALS由超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)基因突变所致。尽管20年前就已发现了SOD1基因突变，但是没有一种疗法可以从本质上延缓散发或SOD1相关ALS的疾病进展。SOD1的毒性作用是继发获得而不是其酶功能缺失引起的，因此减少突变蛋白的表达也许可以延缓SOD1相关ALS的进展。

反义寡聚核苷酸(antisense oligonucletoides，ASOs)是合成的短核苷酸链，其作用机制是根据碱基配对原则结合特定靶mRNA，通过激活核酶RNase H来破坏mRNA。由于ASOs不能通过血-脑脊液屏障，必须直接转移到中枢神经系统才能发挥治疗作用，一个可行的方法是鞘内注射。利用ASOs治疗ALS等神经变性病的证据包括：经脑脊液直接注射后，ASOs广泛分布于中枢神经系统，脑和脊髓中SOD1 mRNA和蛋白的表达降低，SOD1G93AALS动物模型的生存期延长。这些研究中使用的ASOs是ISIS333611，它是一种已经被证实可有效降低转基因大鼠中野生型SOD1蛋白和人细胞中突变人SOD1蛋白表达的ASOs。

在美国4个中心开展了一项随机、双盲、安慰剂对照、剂量递增的Ⅰ期临床研究，来评价SOD1相关的家族性ALS患者鞘内注射ISIS333611的安全性、耐受性和药代动力学。研究发现，家族性ALS患者鞘内注射抑制SOD1表达的反义寡聚核苷酸ISIS333611的耐受性好，脑脊液及血浆中药物浓度与临床前研究一致。

对于散发型ALS，需要采用神经保护方式。保护运动神经元的方法之一是转移生长因子，生长因子转移在临床前研究中显示出前景，但是在临床试验中几乎无效。

【脊肌萎缩症的基因治疗】

脊肌萎缩症(spinal musculor atrophy，SMA)由运动神经元生存1(survival motor neuron 1，SMN1)基因丢失所致，人类有第二个和SMN1高度同源的基因SMN2基因。SMN2不同导致外显子7中含有不同片段，因此产生缩短的、不稳定蛋白，SMN2转录产物小片段经适当拼接形成全长转录产物，疾病严重程度取决于SMN2重复数和SMN2产生的全长SMN数目。作为单基因遗传病，SMA是理想的基因治疗对象。多种反义核酸、基因治疗已进入SMA临床实验。

2014年4月开始了一项SMA患者静脉注射AAV9-SMN的Ⅰ期临床试验(NCT02122952)，验证递增剂量AAV9-SMN的安全性和有效性，计划2017年结束。该研究代表了SMA可能治疗方法的重要进展。

SMA的第二个治疗选择是针对SMN2片段，以促进全长转录产物的合成。这可以通过使用针对外显子7的反义寡聚多核苷酸(ASOs)来实现。这种方式的有效性已在两项临床前研究中被证实。针对SMN2片段的ASOs已开始临床验证。SMA患者鞘内多次给药方案[单剂量(NCT0149701)，多种剂量(NCT01703988、NCT02052791)]已被验证，但是迄今还没有结果报道。两项Ⅲ期试验(NCT02193072、NCT02292537)已开始，还没有结果报道。

【阿尔茨海默病的基因治疗】

1．治疗策略

（1）基因失活：

主要用于减少脑内Aβ的生成。

1）抑制APP的生成：

shRNA转染体外培养的神经元，使APP基因转录过程中的mRNA降解，减少了APP的生成，在阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)小鼠模型中也检测到了APP及Aβ含量的降低。

2）抑制产生Aβ的分泌酶：

β分泌酶和γ分泌酶基因作为基因失活的两个靶点。BACE1是β分泌酶的一种，BACE1基因敲除小鼠Aβ聚集明显减少;RNAi沉默IMR-32细胞内早老素基因后，γ分泌酶的活性降低，Aβ含量也明显降低。

（2）基因修饰：

脑源性神经营养因子(BDNF)和脑啡肽酶(NEP)基因的应用较为广泛。

1）BDNF基因的应用：

BDNF基因注入J20转基因小鼠内嗅区皮质，小鼠的认知、学习和记忆功能得到显著改善。

2）NEP基因的应用：

NEP基因注入APP转基因小鼠双侧大脑半球，治疗6个月后脑皮质区Aβ较对照组减少了48%，并且行为和认知功能有显著改善。

（3）免疫调节：

Aβ疫苗。针对多种Aβ片段的DNA疫苗YM3711免疫后，Tg小鼠脑内Aβ1-42、Aβ寡聚体和Aβ纤维明显减少。

2．AD基因治疗的临床试验

家族性AD由编码APP或前体蛋白降解酶的基因突变所致，一项AAV2-NGF注入基底前脑的Ⅰ期临床试验，随访2年，证实耐受性好。

神经生长因子(NGF)是一种神经营养因子，可以修复神经功能，保护AD患者变性的胆碱神经元，但是生长因子转移的安全性和有效性未被证实。基因转移联合立体定位手术为解决长期存在的转移障碍提供了可能的方法。一项开放性临床试验评估了3种递增剂量的AAV2携带NGF(AAV2-NGF、CERE-110)的安全性、耐受性和初始有效性。

10例AD患者接受双侧Meynert基底节立体定向注射AAV2-NGF，2年后发现，AAV2-NGF治疗安全、耐受性好，PET成像和神经心理测试没有显示疾病进展，尸检脑组织证实长期、靶向、基因介导的NGF表达及生物学活性。该试验为双侧Meynert基底节立体定向注射AAV2-NGF的可行性、良好耐受性和能产生长期具有生物学活性的NGF提供了重要依据，为目前正在进行的一项多中心、双盲、空白手术对照试验的启动提供了支持。

【脊髓小脑性共济失调的基因治疗】

脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia，SCA)是由ataxin基因的CAG异常扩增所致。由于SCA是单基因遗传病，大部分临床前研究都集中在敲除或抑制变异基因。大脑直接注射慢病毒载体或AAV载体编码的RNAi已被用于抑制ATXN3表达，这些研究结果都显示出组织病理和行为改善，提示RNAi作为多种SCA类型的治疗方法有很好前景。

【先天性肌病基因治疗的临床试验】

目前先天性肌病基因治疗的临床试验主要针对肌营养不良多糖复合物缺陷疾病，包括DMD、BMD和LGMD。2004年，Romero等研究发现，向DMD/BMD患者桡侧肌肉局部注射全长抗肌萎缩蛋白质粒后，9例患者中有6例检测到抗肌萎缩蛋白mRNA和抗肌萎缩蛋白表达。受该研究的鼓舞，多种针对恢复抗肌萎缩蛋白表达的基因治疗策略已被应用于临床试验，包括转录通读制剂，外显子跳读寡核苷酸和病毒介导的蛋白编码基因转移。转录通读制剂ataluren的Ⅱa期临床研究报道，治疗1个疗程(28天)后，61%的患者抗肌萎缩蛋白表达增加(NCT00264888)。肌内注射外显子跳读制剂AVI-4658(NCT00159250)后，平均抗肌萎缩蛋白信号增加17%，达到健康对照的22%～32%。

基因治疗在神经科的临床应用虽然才起步不久，但它的应用前景甚为广阔，今后会有迅速和深入发展，会更加成熟、更加安全有效。

（丁新生 王杰）

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