第四节　细胞传代培养技术

细胞传代培养是指细胞从一个培养瓶以1∶2或1∶2以上的比例转移，接种到另一个培养瓶培养。可根据不同细胞采取不同的方法进行细胞传代（表2-4）。

原代培养后，由于悬浮细胞增殖，细胞数量增加甚至达饱和密度；贴壁细胞相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，这种原代细胞经分散接种的过程称为传代。值得注意的是，每次传代后，细胞在生长和增殖方面都会受到一定的影响。

首次传代应注意以下几点：①细胞生长密度不高时，不能急于传代；②原代培养的贴壁细胞需控制消化时间；③动作缓慢轻柔吹打已消化的细胞，减少机械损伤；④首次传代时细胞接种数量要多一些；⑤首次传代培养的pH应偏低些；⑥小牛血清浓度可加大至15%～20%。

一、材料准备及实验步骤

（一）材料准备

1.仪器

CO₂气体、CO₂培养箱、倒置显微镜、超净工作台。

2.材料

细胞培养瓶/皿、一次性试管、一次性移液管、巴氏吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯、培养的细胞。

3.试剂

培养基、FBS、0.25%胰蛋白酶、PBS。

（二）实验步骤

消化细胞的基本步骤：弃去细胞培养液后PBS清洗，加入EDTA-胰酶消化后，加入培养基中止消化，收集细胞，分装培养。

1.进入细胞房之前用肥皂洗手，再用75%的酒精擦拭消毒双手；将培养用液37℃下预热。

2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否传代及细胞需要稀释的倍数。

3.超净台台面应整洁，用75%酒精棉球擦拭清洁。

4.打开超净工作台的紫外灯，照射台面30min，关闭紫外灯，打开风机清洁空气除去臭氧。

5.在超净工作台摆放好物品。

6.将培养用液瓶口用75%酒精消毒，待挥发。

7.吸走培养细胞的旧培养基。酌情可用PBS洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。

8.每个25mL培养瓶加入1mL胰酶，小培养瓶用量酌减，胰酶仅需能刚好覆盖培养皿的底部即可，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察。当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶。

9.加入少量含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清新鲜培养基（7～10mL/大瓶，3～5mL/小瓶）制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖好瓶盖，适度拧紧后稍回转，将培养瓶放回CO₂培养箱。

10.悬浮培养细胞步骤7～9不做。直接将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

二、传代细胞的建系和维持

细胞系的维持通过换液传代再换液、再传代和细胞种子冻存来实现。对每一个细胞系来说都有其自身的特点，要做好建系的维持必须记录好细胞档案，换液传代，做好细胞系（或株）的鉴定和管理工作。

（一）细胞密度

贴壁培养细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代。正常细胞达到汇合状态时会停止生长（接触抑制），重新接种后需要较长时间才能恢复。转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖，但是在经过大约两个倍增时间后细胞性质通常会发生变化。类似的，悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得混浊。

（二）培养基内营养物质的耗竭

生长培养基pH值降低，通常表示乳酸蓄积，乳酸是细胞代谢的副产物。乳酸有细胞毒性，而且pH值减低也是细胞生长的不利因素。pH值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度，细胞浓度越高，培养基耗竭的速度越快。如果发现pH值迅速降低（变化范围0.1～0.2），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。现在的培养基加入了pH指示剂，培养基变紫或变黄都不利于细胞生长。