第三节　原代细胞培养技术

原代细胞培养是指细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段。原代细胞培养的原理是将动物的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置于合适的培养基中培养（表2-2），使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。原代培养物经传代成功后即成细胞系。若不能继续传代或传代有限，称为有限细胞系。如能连续传代，称为连续细胞系。

一、原代细胞的提取

（一）取材的基本要求

1.取材立刻进行原代培养前处理，保持新鲜。

2.整个取材和处理过程应严格无菌。

3.移液枪的轻柔多次吹打以及工具的研磨都会造成细胞损伤，应尽量防止机械损伤。

4.去除无用组织后应避免组织干燥。

5.原始记录应做到记录详实，尤其需要注意记录样本的信息，至少应有年龄、组织的类型、取材日期等。

（二）各类组织的取材技术

1.皮肤和黏膜的取材

方法似外科取断层皮片手术操作，一般取2～4cm²。

2.内脏和实体瘤的取材

需要注意的是，消化道以及内脏外部是无菌的，取材时不要损伤组织导致内脏内部液体污染，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，同时要分清肿瘤以及其他坏死组织，取材尽可能单纯，避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。同组织不同部分其分化起源不同，分子生物学特征也不一样，故取材时应保证一致性。

3.血细胞物质

一般取静脉外周血，分离细胞时、取材时应注意抗凝。

4.胸/腹腔积液或者骨髓细胞

应严格执行无菌操作，注意添加抗凝试剂，采集后应尽快分离培养。离心后，用无盐缓冲液洗涤两次，再用培养基洗一次，培养后尽快处理，不宜低温保存。

5.动物组织取样

①小鼠胚胎组织取样：先将适合死胎的动物用颈部或气管窒息，然后将整个动物浸泡在含75%乙醇的烧杯中。5min后（注意时间不能太长，防止乙醇通过口腔或其他渠道进入体内，影响组织活力）取出，用无菌图钉或大头针将四肢固定在消毒过的木头上，并切开皮肤。用无菌手术刀解剖胚胎或用无菌止血钳夹住皮肤，用无菌眼科剪刀沿着躯干中部切成一个圆圈，用止血钳将两侧皮肤拉到头尾，将动物背部包裹，暴露躯干，然后固定。更换无菌解剖设备，无菌操作解剖胚胎。②幼鼠胚胎肾（或肺）标本：幼鼠按上述方法处死消毒后，腹部向上固定在木板上，先将游离的皮毛剪断并拉至两侧，然后用无菌方法开胸取肺；或背部朝上固定在木板上，先将背部的皮毛剪断拉至两侧，再用无菌方法从背部切开腹腔取肾。

二、原代细胞的分离

（一）单个核细胞的分离方法

如果组织材料来自血液、羊水、胸腔积液或腹腔积液的悬浮物，最简单的方法是用1 000rpm低速离心10min。离心后，由于不同细胞的比重不同，可以在分层溶液中形成不同的层，从而根据需要获得靶细胞。以全血样本为例，在分离液上加入稀释的血液，离心后可获得稀释血浆、单个核细胞、粒细胞和红细胞（图2-1）。

（二）实体组织材料的分离方法

对于固体组织材料，由于细胞之间结合的紧密，为了使细胞在组织中充分分散，形成细胞悬浮液，可以采用机械分散（物理溶解）和消化分离的方法。

1.机械分散法

简单、快速，但对组织的机械损伤大，细胞分散效果差，适用于纤维成分较少的软组织的分离。

2.消化分离法

组织消化法是将组织切成较小的块状（或糊状），利用酶的生化作用和非酶化学作用，进一步疏松细胞间的桥梁结构，使块状组织形成絮状。此时，通过机械方法用吸管或电磁搅拌吹散，或在珠瓶中振荡，使细胞团充分分散。将少量细胞簇和大量单个细胞制成细胞悬液。接种培养后，细胞容易贴壁。

（1）酶消化分离：

常用胰蛋白酶和胶原酶。影响胰蛋白酶效果的主要因素有细胞类型、酶活力、酶浓度、温度、pH、无机盐离子和消化时间。胰蛋白酶的浓度不宜过高，作用时间不宜过长，以免产生毒性。消化后的组织，既要尽量丢弃消化液避免毒性，又要避免漂洗过程中浮肿的细胞流失。

（2）非酶消化法（EDTA消化法）：

EDTA是一种非酶消化法，又称螯合剂或Versene，全称乙二胺四乙酸，常用不含钙、镁离子的PBS配制0.02%的工作液，对某些组织，特别是上皮组织有良好的分散效果。EDTA可与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，联合的机械力可使细胞变圆、分散或使贴壁细胞脱离瓶壁。

以肿瘤细胞为例，常见消化用酶见表2-3。

三、原代细胞的培养和维持

（一）原代细胞的培养

原代细胞最接近和最能反映体内生长特性，适用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。但由于原代细胞的细胞种类并不单一，需要经过两到三次传代才可以纯化细胞。

1.组织块培养法

组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块黏着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。

2.消化培养法

参见前文“消化分离”相关内容。

（二）原代细胞的培养条件

1.静态贴壁细胞（包括半贴壁细胞）的培养

（1）应对细胞进行充分冲洗，尽可能去除消化液的毒性。

（2）接种细胞浓度稍高，至少为5×10⁸个/L。

（3）培养基中可以加入EAGLE（MEM Corning 10-010-CVR）或DMEM（Corning 10-013-CVR）。

（4）胎牛血清浓度分别为10%和20%。

（5）在37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

（6）减少前2天的振荡，防止新贴壁细胞脱落漂浮。

（7）当细胞基本贴壁并逐渐形成网络时，应更换原代细胞的液体。

（8）骨髓或外周血悬浮细胞培养1周后，应低速离心后更换细胞悬液。

2.悬浮细胞的培养要求

（1）在原代培养中应尽可能去除红细胞。

（2）可在含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中进行短期培养。

（3）菌体浓度可在（5～8）×10⁹个/L范围内进行摇瓶分离试验。

（4）在长期培养中，淋巴细胞应加入生长因子，白血病细胞应加入少量患者血清，以促进细胞生长。

（5）细胞液一般每3天更换一半。

（6）只有在细胞增殖加速、细胞密度高的情况下才能进行细胞传代。

3.原代细胞的维护

主要研究结果如下：①当贴壁细胞生长成网状单分子层或基本单层时，未达到饱和密度，需要更换液体以更新营养物质，满足细胞生长繁殖的需要；②用等量的完全培养液或含2%小牛血清的维持液代替；③悬浮细胞培养液不仅会发生转化，而且会发生分裂和繁殖，此时培养液中的营养物质不能维持细胞的营养需求，需要更换液体。通常采用半量液体交换方法。