第二节　细胞焦亡的分子机制

细胞焦亡是一种不同于坏死、凋亡和自噬的新型细胞死亡模式，对其机制的深入研究将有助于对其进行调控，为疾病防治提供新思路。细胞焦亡的机制目前尚不完全清楚，研究表明炎症小体组装激活在细胞焦亡中发挥关键性作用。

炎症小体的概念于2002年由Tschopp团队首次提出，是指由胞质型模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）参与组装的多蛋白复合物，其受体能够通过病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）或者宿主来源的危险/损伤相关分子模式（danger/damage-associated molecular patterns，DAMPs），招募和激活炎性caspase。目前认为，炎症小体的激活包括经典和非经典两条途径，它们分别活化炎性caspase-1或caspase-4、caspase-5、caspase-11，炎性caspase可直接剪切激活GSDMD生成N端片段，介导质膜孔隙的形成，诱导细胞发生焦亡。已有研究表明，细胞焦亡的发生主要有caspase-1依赖及caspase-1非依赖两种途径，caspase-1非依赖的细胞焦亡主要由人caspase-4、caspase-5或鼠caspase-11介导。

一、caspase-1依赖的经典焦亡途径

炎症小体依据受体的种类进行命名，迄今为止，人们已经发现多种类型的炎症小体，常见的有核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）样受体（NOD-like receptor，NLR）家族炎症小体及黑素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）炎症小体。

NLR家族是一类进化上比较保守的蛋白质，对免疫功能的调节发挥起着重要作用，已发现人类NLR家族至少有22种成员。NLR家族炎症小体的感受器（受体）可接收PAMPs或DAMPs等不同的刺激信号，通过衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing caspase recruitment domain，ASC）募集效应蛋白前体（pro-caspase-1），组装形成炎症小体。也有的炎症小体（如NLRP1和NLRC4）组装可不需要衔接蛋白ASC，其受体本身就具有半胱天冬酶募集结构域（caspase recruitment domain，CARD），可直接募集procaspase-1。炎症小体组装完成后具有自我激活作用，使pro-caspase-1（45kDa）发生水解，生成20kDa、10kDa两个片段，形成具有活性的P10/P20四聚体。caspase-1也称为白细胞介素1β 转换酶（interleukin-1β converting enzyme，ICE），可促进pro-IL-1β和pro-IL-18的切割成熟，生成具有活性的IL-1β和IL-18等促进炎症级联反应。此外，caspase-1还可直接剪切激活GSDMD蛋白，介导质膜孔隙的形成，诱导细胞在炎性和应激的病理条件下发生焦亡，这是细胞焦亡发生的经典途径。

AIM2炎症小体由受体AIM2、衔接蛋白ASC和效应蛋白caspase-1组成。AIM2蛋白具有一个C端HIN200结构域和一个N端热蛋白结构域（pyrin domain，PYD），可通过HIN200结构域特异性识别细胞质中的双链DNA，诱导自身寡聚化，然后通过PYD-PYD相互作用而与ASC结合，并募集效应蛋白前体pro-caspase-1组装形成炎症小体，促进caspase-1的激活以及IL-1β和IL-18的成熟。AIM2炎症小体在对抗细菌和DNA病毒感染时发挥着重要作用。

目前研究较多且与细胞焦亡相关的有NLR家族炎症小体中的NLRP1、NLRP3、NLRC4（又名IPAF）炎症小体以及AIM2炎症小体，其中NLRP3炎症小体又是目前研究最为广泛的炎症小体，对其机制相对了解得比较清楚，因此本章以NLRP3炎症小体的激活为例重点阐述细胞焦亡过程中炎症小体组装、caspase-1激活、下游炎症因子产生和其他后续事件的发生机制（图4-1）。

（一）NLRP3炎症小体及其诱导信号

NLRP3炎症小体的受体为核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族热蛋白结构域蛋白3（nucleotide-binding and oligomerization domain（NOD）-like receptors family，pyrin domain containing 3，NLRP3，又称NALP3）。NLRP3蛋白由三个基本结构域组成：①C端的富含亮氨酸重复（leucine-rich repeat，LRR）结构域，具有识别配体的功能；②中心区的核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding and oligomerization domain，NACHT），对于受体自身的寡聚化和活化非常重要；③N端的PYD，能通过PYD-PYD相互作用与ASC结合。ASC的分子质量为21.5kDa，有195个氨基酸残基，包含PYD和CARD两个结构域，分别通过PYD结构域连接上游的NLRP3和CARD结构域连接下游的pro-caspase-1。

多种病原体及细胞内外刺激物可被LRR识别，使NLRP3蛋白结构发生变化，暴露出NACHT结构域，进而聚合形成高度有序的NLRP3蛋白寡聚体，并通过PYD-PYD结构域募集ASC，形成分子平台；再通过CARD-CARD结构域招募pro-caspase-1，完成炎症小体的组装。如前所述，NLRP3炎症小体组装完成后具有自我激活作用，使pro-caspase-1水解生成活性形式的caspase-1，并进一步促进IL-1β和IL-18成熟，启动炎症级联反应，剪切GSDMD蛋白，诱导细胞焦亡。NLRP3炎症小体活化的刺激信号包括以下两大类：

1.病原体相关分子模式

PAMPs主要是指病原微生物共有的某些高度保守的分子结构，包括①细菌胞壁成分，如G-菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），G+菌的寡肽糖和真菌的酵母多糖等；②病毒产物及细菌胞核成分，如非甲基化寡核苷酸CpGDNA、单链RNA、双链RNA等。PAMPs种类有限，但在病原微生物中分布广泛，为病原微生物所特有，且宿主细胞不产生，是宿主固有免疫细胞泛特异性识别的分子基础。固有免疫识别的PAMPs，往往是病原体赖以生存、变化较少的主要部分，如细菌的脂多糖和病毒的双链RNA，对此，病原体很难产生突变而逃脱固有免疫的作用。

2.危险/损伤相关分子模式

DAMPs是组织或细胞受到损伤、缺氧、应激等因素刺激后释放到细胞间隙或血液循环中的一类具有免疫调节活性的物质。目前已证实许多DAMPs可激活NLRP3炎症小体，主要包括以下几类：

（1）高迁移率族蛋白1（HMGB1）：

于1973年首次在牛胸腺中被提取和鉴定，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移能力而得名。高迁移率族蛋白是一种高度保守的、分子质量为30kDa的核蛋白，广泛分布于哺乳动物细胞。细胞外HGMB1有两种来源：一是坏死细胞被动释放，二是细胞受到炎症刺激（包括DAMPs刺激）后主动分泌。近年的研究发现，HMGB1一旦分泌到细胞外，即可发挥致炎作用。现在认为，HMGB1是一种重要的晚期致炎因子，近年来已成为危重医学研究的热点之一，其在全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）中的作用广受关注。当组织缺血或其他原因导致无菌性细胞损伤时，HMGB1作为调节介质释放至细胞外，细胞凋亡时HMGB1则与染色体不可逆结合而不被释放到细胞外。

（2）热休克蛋白（HSP）：

是一种保护性蛋白，作为分子伴侣参与细胞内蛋白质折叠、转运和组装；当受到高温等恶劣环境袭击时，HSP就会被大量合成，以提高细胞的应激能力。细胞损伤和坏死可将HSP主动或被动释放至细胞外，而胞外HSP可被包括TLR在内的多种受体识别，进而激活炎症小体，诱导促炎介质的合成和分泌，参与炎症及其调节过程。

（3）S100蛋白：

是一组分子质量较小（9~13kDa）的钙结合蛋白，因其在中性饱和硫酸铵中100%的溶解而得名，目前已发现20个S100蛋白家族成员，其中S100A8、A9和A12由吞噬细胞合成并在炎症部位释放。S100蛋白对中性粒细胞有趋化作用，能与TLR4结合，从而介导细胞内的炎症信号转导，在感染、类风湿关节炎、肠道及肾脏等炎症反应中发挥重要作用。

（4）嘌呤分子及其降解产物：

如ATP、尿酸等。生理状态下，ATP是维持细胞正常代谢功能的主要能量物质。当细胞应激、缺氧、受损等情况下，ATP及其代谢产物ADP、腺苷等可作为DAMPs，通过主动或被动方式释放至胞外。嘌呤受体是细胞外ATP及其代谢产物的结合受体，高浓度ATP可在短时间内通过细胞表面P2X7受体，激活NLRP3炎症小体。

（5）晶体或颗粒性物质：

细胞受损后可释放出大量尿酸，使受损组织周围环境中尿酸处于超饱和状态，形成结晶体。尿酸结晶被细胞吞噬后形成吞噬溶酶体，可致溶酶体的肿胀和破坏，使溶酶体内的组织蛋白酶B（cathepsin B）释放出来，诱导NLRP3炎症小体激活。胆固醇结晶和尿酸盐结晶一样，可被细胞吞噬后形成吞噬溶酶体，可致溶酶体的肿胀和破坏，组织蛋白酶B释放，诱导NLRP3炎症小体激活。此外，β淀粉样蛋白、二氧化硅、明矾、石棉等晶体或颗粒性物质也可作为DAMPs，通过相同的机制诱导NLRP3炎症小体激活。

（6）细胞外基质降解产物：

细胞外基质是由细胞合成并分泌到胞外，分布在细胞表面或细胞间的大分子，主要包括透明质酸、硫酸肝素、胶原蛋白及弹性蛋白等成分。正常状态下，这些大分子在细胞间交织连接形成网状结构，一方面维持细胞形态结构，另一方面可调节一些免疫细胞和上皮细胞活性，发挥免疫调节功能。在微生物感染、缺血、缺氧或炎症所致组织损伤过程中，受损/坏死组织释放大量蛋白酶，导致细胞外基质迅速降解，积聚于组织间隙。这些降解的细胞外基质成分也可作为DAMPs，激活炎症小体。

（二）NLRP3炎症小体的激活过程

NLRP3炎症小体的激活过程分为两个阶段：①第一阶段为预激（prime）阶段。一般认为，此阶段信号主要与细胞膜上的TLR等结合，激活核转录因子NF-κB，转录合成炎症小体组分及多种炎症因子前体如NLRP3、pro-caspase-1和pro-IL-1β，为后续炎症反应提供物质基础。②第二阶段为组装（assembly）阶段，亦即激活阶段。此阶段，各种NLRP3激动信号与NLRP3受体结合，通过衔接蛋白ASC招募pro-caspase-1，组装成大分子复合物即炎症小体，通过自我激活作用水解产生具有活性的caspase-1，并进一步促进下游更多种促炎介质（如IL-1β、IL-18等）及趋化因子的合成分泌。caspase-1的激活，还能介导细胞焦亡，焦亡细胞释放大量促炎内容物，反过来再促进炎症小体的组装激活，恶性循环引起炎症反应扩散、放大。

（三）NLRP3炎症小体的组装激活模式

NLRP3炎症小体组装激活的具体分子机制还不完全清楚，目前认为，NLPR3炎症小体的组装主要有以下三种模式：

1.离子通道模式

细胞损伤或坏死时释放至胞外的ATP激活细胞表面的ATP门控的离子通道P2X7，触发K+外流，同时招募半通道蛋白pannexin-1在细胞膜上形成孔隙，从而容许NLRP3炎症小体的激活物进入细胞内激活NLRP3炎症小体。此外，胞内K+浓度远远高于胞外，当细胞膜的稳定性减弱膜通透性增加时，胞内K+也会被动外流，一些病原体或源自病原体的物质如膜穿孔毒素可通过削弱细胞膜稳定性使K+外流来激活NLRP3炎症小体。提高细胞外K+浓度来阻止胞内K+外流时，许多激活剂对NLRP3炎症小体的激活受到了抑制，这也从侧面证实了K+外流对NLRP3炎症小体激活的作用。

2.溶酶体模式

细胞吞噬胞外环境刺激物如尿酸、胆固醇、铝、硅石等晶体或颗粒性物质，形成吞噬体，后者与溶酶体融合，引起溶酶体的肿胀和破坏，使溶酶体内的组织蛋白酶B等释放出来，进而激活NLRP3炎症小体。至于组织蛋白酶B通过什么机制激活NLRP3炎症小体，目前仍不清楚。

3.活性氧模式

许多NLRP3炎症小体激活剂在激活NLRP3炎症小体时都能够引起细胞内ROS升高，但是关于ROS的来源目前尚不十分明确。一种目前普遍认可的观点认为线粒体是NLRP3炎症小体激活过程中ROS的主要来源。在吞噬细胞吞噬病原体的过程中，为了满足大量能量的需求，线粒体会通过增加呼吸来实现能量的供给，与此同时，呼吸的增加导致了大量ROS的产生。另一种观点认为，还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶复合体是颗粒性物质激活NLRP3炎症小体过程中ROS的主要来源。硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）及硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）系统的失衡被认为与ROS所致的NLRP3炎症小体激活密切相关。研究表明，TXNIP可直接与NLRP3结合，进而激活NLRP3炎症小体；此外TXNIP也可与Trx结合，封闭其抗氧化活性。

上述NLRP3组装激活的三种模式并不是独立的，而是存在非常紧密的关系，可单独或共同作用激活NLRP3炎症小体。几乎所有PAMPs或DAMPs均能刺激ROS的生成，因此ROS模式在NLRP3炎症小体激活的作用尤为受到关注。

二、caspase-1非依赖的焦亡途径

caspase-1非依赖的焦亡途径，主要由鼠caspase-11或人类同源基因caspase-4、caspase-5介导。caspase-4、caspase-5、caspase-11的活化由非经典的炎症小体激活介导。

非经典的炎症小体激活由胞质内LPS感受器感受胞质中的LPS，并募集pro-caspase-11形成分子平台，pro-caspase-11自我激活生成活性形式的caspase-11。近期研究发现，小鼠caspase-11和人caspase-4、caspase-5自身就是LPS的细胞内受体。caspase-11的CARD结构域特异地、高度亲和地结合LPS的类脂质A结构，这种结合使caspase-11自身发生寡聚化，并持续激活其自身的酶活性。此外，在某些特定条件下，caspase-11激活可介导经典的NLRP3炎症小体激活及caspase-1活化。人类没有caspase-11，但其同源caspase-4、caspase-5具有与caspase-11相同的功能和激活方式。

caspase-4、caspase-5、caspase-11识别胞内LPS需要细菌从胞内液泡中逃逸，这个过程可被干扰素诱导的GTP酶介导的含菌液泡裂解所促进。炎性caspase-4、caspase-5、caspase-11被LPS激活的非经典途径不仅代表了先天免疫的新模式，而且研究发现其在LPS诱导的脓毒性休克中发挥独特的作用，研究发现，caspase-11-/-小鼠能抵抗致死剂量的LPS，而caspase-1-/-小鼠无此作用。

caspase-1非依赖的细胞焦亡与caspase-1依赖的经典细胞焦亡的不同在于，caspase-4、caspase-5、caspase-11不能直接剪切炎症因子前体pro-IL-1β和pro-IL-18，因此不能促进IL-1β和IL-18的成熟。虽然近期有研究报道caspase-4具备剪切pro-IL-1β和pro-IL-18的能力，但仍需进一步证实。

三、细胞焦亡的执行

GSDMD被认为是细胞焦亡的执行者。研究人员通过构建GSDMD基因敲除（GSDMD-/-）的细胞模型，发现GSDMD是细胞焦亡发生的必要条件，GSDMD缺失可以抑制所有已知经典及非经典炎症小体引起的细胞焦亡，而在GSDMD-/-细胞中外源表达GSDMD可恢复细胞焦亡的发生。进一步研究发现在GSDMD-/-小鼠身上，由NLRP3、NLRC4及AIM2等炎症小体所介导的经典焦亡进程均无法启动。这些研究结果说明了GSDMD蛋白在caspase-1或caspase-4、caspase-5、caspase-11诱导的细胞焦亡中不可或缺的作用。此外，研究发现，GSDMD的缺失并不抑制caspase-1本身的活化和对下游IL-1β的切割，但却能阻止成熟的IL-1β分泌到细胞外。

GSDMD存在于细胞质中，在稳定的内环境中，GSDMD处于自身抑制的状态。目前多数学者认为，细胞焦亡相关的炎性caspase（caspase-1或caspase-4、caspase-5、caspase-11）都可以直接剪切GSDMD。GSDMD的剪切位点为Asp276（鼠）或Asp275（人），使其水解生成一个N端P30片段（GSDMD-NT）和一个亲水的C端P20片段（GSDMD-C）。GSDMD-NT与相应的GSDMD-C分离后，能特异性地结合于细胞膜的脂质双分子层，组成环状低聚物，从而在细胞膜上形成直径为10~15nm的小孔（gasdermin孔），破坏细胞膜的完整性，使膜内外离子梯度遭到破坏，K+外流、Na+内流，大量促炎介质IL-1β和IL-18也能通过膜孔主动分泌至细胞外；随着细胞内渗透压增加，水通过渗透作用进入细胞，造成细胞肿胀、裂解，诱导细胞焦亡。促炎介质IL-1β、IL-18及细胞内其他内容物大量被动释放，启动炎症级联反应，放大局部和全身炎症。GSDMS-C同样也有相当重要的作用，能抑制GSDMD-NT的细胞毒性，增加GSDMD-NT的水溶性，当它与GSDMD-NT结合时则发挥了结构自抑制的作用。

GSDMD是gasdermin蛋白家族中的一员，该家族成员包括gasdermin A、B、C、D、E（亦称为DFNA5）及DFNB59。最新研究表明，gasdermin E（GSDME），可以被caspase-3切割，且切割的位置、效率及结果和caspase-1切割GSDMD非常类似，即释放出具有膜成孔活性的N端结构域并诱导细胞焦亡，这一发现不但提示GSDMD不是细胞焦亡的唯一执行者，GSDME也可执行细胞焦亡的功能，而且打破了caspase-3导致细胞凋亡的经典概念，首次展示了caspase-3活化也可以导致细胞焦亡。值得注意的是，GSDME被caspase-3切割后虽然可以诱导细胞焦亡，但是癌症细胞由于DNA甲基化介导的表观遗传沉默导致GSDME不表达，而很多正常组织高表达GSDME，因此在化疗药物处理激活caspase-3后，这些正常细胞会发生GSDME的活化并以焦亡的方式死去，而癌细胞由于不表达GSDME，caspase-3活化则诱导细胞以凋亡的方式死去。对GSDME-/-小鼠的研究发现，化疗药物导致的多种组织损伤和体重下降等副作用都得到了明显的缓解，提示传统化疗药物有很大的毒副作用，很可能是因为这些药物导致正常组织发生了细胞焦亡。

虽然gasdermin蛋白家族成员共享具有膜成孔活性的N端结构域，但是gasdermin蛋白家族的其他分子是否也具有执行细胞焦亡的效应有待进一步研究。鉴于GSDMD被caspase-1或caspase-4、caspase-5、caspase-11切割而活化，而GSDME可被caspase-3切割而活化，其他的gasdermin家族蛋白并不能被caspase-1或caspase-4、caspase-5、caspase-11切割而活化，因此有学者建议将细胞焦亡的概念重新定义为“由gasdermin家族蛋白介导的程序性细胞死亡”。