1.4.4　沼液指标分析

水解发生在固相秸秆上，产生的可溶性产物进入沼液发酵产酸。因此，沼液中发酵参数的变化反映了产酸与产甲烷的平衡。常用的监控指标有pH、VFAs、碱度、氨氮浓度、氧化还原电位等，在一些连续运行的反应器中，总VFAs和碱度比（TVFA/TIC）及溶解性有机物（DOM）组分的变化是重要的预警指标。

1.4.4.1　pH

不同的pH会形成不同的生态位，有利于特定菌群的生长。如Hu等[113]的研究表明，接种瘤胃体系纤维素降解效率会随着pH的提高而增加。而Romsaiyud等[114]的研究表明水解菌最适pH范围在5.3～8.3之间，过低pH会对水解菌产生离子毒性，降低水解酶活[115]。

甲烷菌最适的pH范围不同。如中温发酵中，Methanobacterium最适pH为6.6～7.8，Methanosarcina为6～7，Methanosaeta为7.0～7.5。而嗜热型甲烷菌的最适pH比中温高，如Methanothermobacter thermoautotrophicum最适范围为7.0～8.0[9]，由此可见，甲烷菌的最适pH生态幅度比水解菌和产酸菌要窄。6.5～8.2是大多数研究所采用的产甲烷pH范围[116]。pH低于该范围产甲烷活性受到抑制[4]。因此调控pH有利于产甲烷效率的提高，如Yang等[117]研究表明，高固态餐厨垃圾厌氧发酵易引起严重的酸化和产甲烷抑制。将pH调为8时，甲烷产率和甲烷含量分别达到了171.0mL/g TS和53.1%，高于未调控组，研究者将pH效应归因于水解酶活和产甲烷途径中辅酶F420的提高。

1.4.4.2　总VFAs与碱度比（TVFA/TIC）

秸秆发酵体系VFAs主要包括乙酸、丙酸及丁酸等，它们对体系的影响各不相同。Romsaiyud等[114]的研究表明，乙酸浓度高于1.5g/L会影响纤维素酶的产生，从而导致纤维素水解菌的活性受到抑制。Xiao等[118]在研究乙酸对产甲烷活性影响时发现，乙酸浓度为1619.47mg/L时产甲烷不受抑制，但达到3000mg/L时，活性完全受到抑制。从反应动力学来看，乙酸作为嗜乙酸型甲烷菌和乙酸氧化菌的底物，浓度的高低同样影响乙酸代谢的途径[119]。丙酸（或丁酸）是厌氧发酵受抑制的重要指标。OLR提高，丁酸代谢加快，产生的氢和还原力NADH被利用产甲烷，但超过甲烷菌的代谢能力时，通过产丙酸途径得到释放[100]。如Ahring等[120]的研究表明，当温度从55℃升至59℃时，丁酸浓度升高的指标比体系受抑制出现时间提前2d。Deng等[42]在稻秸单瘤胃接种体系中发现，当OLR达到7g/（L·d）时，丙酸的积累标志着产甲烷受到了抑制。

VFAs积累易造成体系酸化，但体系中存在的碳酸盐、重碳酸盐及少量氨氮离子缓冲了VFAs对pH的影响，这种能力可以用碱度来表示。根据Raposo等[102]的报道，厌氧体系最理想的碱度范围为2500～5000mg CaCO₃/L，能缓冲VFAs浓度升高造成的影响，使pH维持在小范围内变化。由此可见，pH对体系VFAs积累有一定的迟滞性，而TVFA/TIC，也称FOS/TAC，常用于衡量体系缓冲能力，能及时反映运行状况。当比值小于0.4，表明产酸与产甲烷达到平衡；比值大于0.8是体系酸化的信号[121]。

1.4.4.3　氨氮浓度

补充的氮源除被厌氧微生物利用外，剩余部分以氨氮离子和游离氨的形式存在于沼液中。高浓度游离氨能以被动扩散的方式自由透过细胞膜进入细胞，与K+发生交换，破坏K+依赖型ATP离子泵，从而对厌氧菌产生毒害[116，122，123]。游离氨浓度的计算如公式（1.1）所示：

　　（1.1）

式中，FAN为游离氨浓度，mg/L；TAN为总氨氮浓度，mg/L；pK_a是氨氮的解离常数；T为温度，℃。

由此可见，游离氨的浓度受总氨氮、pH和温度的影响；当总氨氮浓度相同，高温发酵（50～55℃）中游离氨浓度大约是中温发酵（35～40℃）的6倍。因此高温发酵更易受到氨氮抑制[92]。研究表明，氨氮浓度在200mg/L就能保证厌氧微生物生长的需要[93]；1500mg/L氨氮浓度作为抑制的阈值，对厌氧发酵有抑制作用；中温、pH 7.6条件下，超过3000mg/L阈值会对产甲烷活性产生显著抑制[93，124]。但研究也表明，活性污泥经过驯化，氨氮抑制的阈值浓度可以达到5000mg/L以上[123，125]。

甲烷菌受氨氮抑制的机制不同。如Methanosarcina是不规则的球菌，常形成包囊或聚合体，而Methanosaeta呈棒状结构，形态特征的不同决定了Methanosarcina比Methanosaeta对氨氮的耐受浓度更高[9]。如Calli等[76]在运行中温UASB反应器时，游离氨浓度达到100mg/L时，Methanosaeta丧失产甲烷活性，丝状结构受到破坏，Methanosarcina反而成为优势菌群。氨氮对嗜乙酸型和嗜氢型甲烷菌的影响有不同的报道。如Sprott等[122]研究认为游离氨进入嗜氢型甲烷菌（如Methanobrevibacter、Methanobacterium）细胞内部破坏K+平衡，比Methanosarcina更易受到氨氮影响。但也有报道认为，嗜乙酸产甲烷途径在高氨氮条件下受到抑制，一些对耐受性强的嗜氢型伴生菌（如Methanoculleus、Methanothermobacter）能形成互营氧化菌群发挥作用[125，126]。如在市政分选垃圾中温发酵中，当总氨氮浓度达到3000mg/L时，乙酸互营氧化逐渐成为主要产甲烷途径[126]。上述研究表明，还原氢通过乙酸互营氧化途径得到释放，是厌氧微生物应对氨氮抑制的重要适应性机制。

1.4.4.4　DOM中荧光组分分析

DOM主要包括来源于接种物的有机质、秸秆降解副产物及微生物代谢物等成分，会对厌氧发酵产生影响[127]。很多有机物都有特定的三维荧光峰，可以利用三维荧光光谱技术（excitation-emission matrix, EEM）来测定。

如污泥和环境水样中包含可溶性腐殖质，它们的荧光峰在一定荧光范围内出现，如根据Chen等[128]的划分，激发波长（Ex）＜250nm，发射波长（Em）＞350nm范围（Ⅲ区）属富里酸类物质；Ex＞280nm，Em＞380nm范围（Ⅴ区）属腐殖酸类物质。一些微生物代谢物也具有特定荧光峰。如280nm/340nm（Ex/Em）荧光峰是蛋白质芳香族氨基酸结构（色氨酸或酪氨酸）的特征峰，一般认为是微生物代谢产物或在衰亡自溶中产生[129]；340nm/430nm（Ex/Em）是辅酶NADH的特征峰[130-132]；辅酶F420是嗜氢型产甲烷代谢独有的电子载体，特征峰位于420nm/470nm（Ex/Em）[125，130]。

由于荧光强度能反映荧光组分浓度的变化[133]，荧光峰可用于特征荧光物质的监控。如LI等[134]利用三维荧光光谱-平行因子分析技术（excitation-emission matrix and parallel factor analysis, EEM-PARAFAC）研究脱水污泥的厌氧消化过程，识别出腐殖酸类（humic-like）、富里酸类（fulvie-like）以及蛋白类荧光峰，根据荧光强度的变化，得出蛋白和腐殖酸类物质的降解顺序；发现腐殖酸类物质能竞争抑制嗜乙酸产甲烷活性，造成VFAs的积累[135]。刘怡心等[136]通过EEM-PARAFAC技术识别出了厌氧氨氧化反应器中富里酸类特征峰，而且还利用荧光代谢物表征反应器运行指标。Sabatini等[131]在中温厌氧产氢反应器出水中，解析出代谢物荧光蛋白和NADH。李卫华等[132]应用EEM表征了高温厌氧反应器的出水，采用PARAFAC法识别出3种荧光组分（蛋白类、辅酶NADH和核黄素），它们与反应器的运行密切相关。