实例精讲　典型氨基酸类药物的生产与质量控制

实例一　L-天冬氨酸的生产与质量控制

（一）L-天冬氨酸概述

L-天冬氨酸（L-aspartic acid，L-Asp）是天然存在的一种氨基酸，也称丁氨二酸、L-天冬酸、L-天门冬氨酸或L-氨基琥珀酸。其化学性质稳定，为白色晶体或结晶粉末，有微酸味道；25℃微溶于水（0.5%），可溶于沸水，易溶于稀酸和NaOH溶液，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，270℃发生分解，pI为2.77，比旋光度与溶解溶剂有关；在酸性和水溶液中为右旋，碱性溶液中为左旋。[α]＝＋5.05°（c＝0.5～2.0g/mL，H₂O）。

L-Asp的化学结构如图2-1-1所示。

L-Asp是氨基酸输液的重要组成部分。L-天冬氨酸钾和L-天冬氨酸镁是钾、镁的有效补充剂，可用于心脏病的治疗，也可作为肝功能促进剂和氨解毒剂，对洋地黄等强心苷类中毒引起的心律失常也有较好的治疗作用，并可解除恶心、呕吐等中毒症状，还可用于维生素B₆及抗肿瘤药物的合成。

（二）L-天冬氨酸的生产方法

L-Asp主要以化学合成法、微生物发酵法和固定化细胞法生产为主。

1．化学合成法

化学合成法是以马来酸或富马酸及其酯为原料，在加压条件下用氨处理，然后进行水解得到外消旋的天冬氨酸，反应得到的外消旋天冬氨酸由于没有较好的拆分方法，给L-Asp的分离与纯化带来了不便，故应用较少。氨基酸常用化学合成方法有斯瑞克合成法——醛的氨氰化法、赫尔-乌尔哈-泽林斯基α-溴化法、丙二酸酯法、盖布瑞尔法等，其合成原理如图2-1-2所示。

天冬氨酸还可通过以下的化学合成法进行合成，需要原料有顺丁烯二酸酐（49g，0.422mol）、苄胺（107g，1mol）、冰醋酸、钯-炭催化剂（含30%氯化钯）、丙酮以及刚果红试纸等，其合成技术路线如图2-1-3所示。

L-Asp合成步骤（实验室规模）如下：

① 在500mL三口瓶中，加入49g顺丁烯二酸酐与150mL水沸腾回流30min。

② 冷却条件下慢慢加入107g苄胺并继续回流1h，冷却后加入丙酮使沉淀完全，产物N-苄基-天冬氨酸苄胺盐（Ⅰ）在乙醇中重结晶。

③ 50g Ⅰ溶于60mL 15% NaOH溶液，以乙醚反复萃取苄胺多次后，碱性溶液用盐酸酸化至刚果红试纸呈酸性反应，冷却后分离出白色结晶N-苄基-天冬氨酸（Ⅱ）。

④ 将5g Ⅱ悬浮于110mL冰醋酸及钯-炭催化剂（含30%氯化钯）0.3g（钯-炭催化剂加入时不能掉在瓶外，否则容易引起着火）中，在60℃下低压催化氢化3h（必须在升温之前用氢气将瓶内空气置换3次）。反应物冷却后过滤。

⑤ 滤渣以冷甲酸洗涤，合并滤液及洗涤液，蒸去溶剂得到L-Asp。烘干后称重，计算产率，测其熔点。天冬氨酸为无色单斜棱柱形结晶，熔点为278～280℃。

2．微生物发酵法

微生物发酵法是在微生物酶的催化作用下，以富马酸与氨为原料，通过加成反应生成天冬氨酸，产物只有左旋体，收率高，此为L-Asp工业化生产的主要方法。目前，以产生天冬氨酸酶的微生物菌体直接转化富马酸和氨生产L-Asp的固定化细胞法应用较为广泛，天冬氨酸酶（EC4.3.1.1）可催化反丁烯二酸（富马酸）与氨合成L-Asp。反应式如下：

3．固定化细胞法生产L-Asp

以卡拉胶为包埋材料固定化高天冬氨酸酶活性的大肠杆菌细胞，并制成生物反应器实现L-Asp的连续生产，其反应工艺路线如图2-1-4所示。

卡拉胶是一种优良无毒的天然凝胶包埋材料，由海藻中提取，作为细胞固定化包埋材料，具有机械性能较好、操作方便、稳定性较好、包埋条件温和等优点，常作为微生物菌体和微生物酶的包埋材料，对酶活性和细胞代谢无影响。固定化细胞技术是利用物理或化学手段将游离的微生物细胞、动物细胞定位于限定的空间区域，并使其保持活性且能反复利用的一项技术。它的制备方法有吸附法、共价交联法、絮凝法、包埋法，其中包埋法因操作简单、对细胞毒性小以及效率高而被广泛使用，是目前细胞固定化的重要手段。

（1）大肠杆菌细胞固定化

① 菌种活化　将冷冻（冷藏）保存的大肠杆菌菌体用LB培养基于37℃培养过夜。取1mL已活化的处于对数生长期的大肠杆菌种子液接种至50mL灭菌种子培养基中（10%延胡索酸铵、2%玉米浆、2%牛肉膏、0.5%KH₂PO₄、0.05% MgSO₄·7H₂O，pH 7.0），37℃振荡培养24h，3000r/min离心20～30min，去上清液，菌体用无菌生理盐水洗涤2次，离心收集菌体，于4℃冷藏备用。

② 大肠杆菌细胞固定化　称取4g大肠杆菌湿菌体振荡悬浮于5mL无菌生理盐水中，45℃恒温5min，加1.0g卡拉胶于20mL无菌生理盐水，加热至70～80℃使其溶解，降温至45℃，并将悬浮大肠杆菌菌体与冷却至45℃的卡拉胶混合均匀，4℃冰箱中放置30min成型。将成型凝胶在100mL 0.3mol/L KCl溶液中浸泡4h，然后切成3mm³的立方体方块的颗粒。经无菌生理盐水洗涤2次后，将固定化细胞加入含有1mol/L延胡索酸铵的溶液中于37℃活化24h，即可使用。

（2）天冬氨酸酶酶活力测定与延胡索酸标准曲线绘制

① 湿菌体天冬氨酸酶酶活力测定　称取0.5 g湿菌体悬浮于2mL无菌蒸馏水中，加入30mL 1.0mol/L延胡索酸铵溶液（含1mmol/L MgCl₂、1%Triton，pH 9.0），并于37℃搅拌反应30min，100℃灭酶，3000r/min离心5min。上清液经适当稀释后于240nm波长处测定吸光度并计算延胡索酸残余量，计算酶活力。一个酶活力单位定义为：在测定条件下，每小时每克细胞转化生成1μmol天冬氨酸所需酶量。

② 固定化细胞天冬氨酸酶酶活力测定　取相当于0.5g天然细胞的固定化细胞，置于30mL 1.0mol/L延胡索酸铵溶液（含1mmol/L MgCl₂），37℃搅拌反应30min，迅速过滤除去固定化细胞，分离反应液，适当稀释后于240nm波长处测定吸光度，计算延胡索酸残余量，并计算酶活力。总活力用每克固定化细胞每小时内所产生的L-Asp物质的量（μmol）表示[μmol/（h·g）]。

③ 延胡索酸标准曲线的绘制　延胡索酸在240nm波长处有特征性的吸收峰，在一定范围内，其吸光值与延胡索酸浓度呈正相关，且反应体系没有干扰。按表2-1-2配置延胡索酸标准梯度溶液，并于240nm波长处测定吸光值，记录在表中。以延胡索酸标准液浓度为横坐标，以测定得到的吸光值A₂₄₀为纵坐标，通过一元线性回归分析，得到标准曲线方程并制作线性回归曲线。

（三）L-天冬氨酸的质量控制

1．天冬氨酸酶酶活力的测定

称取6g固定化的大肠杆菌菌体装入恒温的固定化生物反应器（15cm×30cm）中，底物延胡索酸铵（含1mmol/L MgCl₂，pH9.0）以1.0mol/L恒速流过固定化细胞柱，空速（SV，指在连续流动的反应器中单位时间内通过单位天冬氨酸酶床层的延胡索酸量）＝0.87h^－1，流出液于240nm处测定延胡索酸含量并计算天冬氨酸酶酶活力和转化率。固定化酶的半衰期通过酶活力的衰变速度和工作时间的指数关系确定。

2. L-Asp质量分析

L-Asp质量分析方法和标准参照国家行业标准QB/T 1118—1991。含量（99.5%）采用高氯酸滴定测定，比旋光度（24.5°～26.5°）采取旋光仪测定，硫酸根（≤200mg/L）采取比浊法测定，铁盐（≤10mg/L）采取比色法测定，氯离子（≤200mg/L）采用比浊法测定，铵盐采用比色法测定，延胡索酸采用分光光度法测定。L-Asp质量检测分析结果记入表2-1-3中。

实例二　L-赖氨酸的生产与质量控制

（一）L-赖氨酸概述

L-赖氨酸（L-lysine，L-Lys），也称L-己氨酸、L-2，6-二氨基己氨酸，分子式为C₆H₁₄N₂O₂，分子量为146.19，无色针状结晶，比旋光度＋14.6°（c＝6.5）、＋25.9°（c＝2，6.0mol/L HCl）。L-赖氨酸化学结构式如图2-1-5所示。

其在水溶液中，0℃溶解度为53.6g/100mL、25℃时为89g/mL、50℃时为111.5g/mL，微溶于乙醇，不溶于乙醚。游离赖氨酸在空气中易吸入CO₂，制得赖氨酸晶体比较困难，工业上常以赖氨酸盐酸盐形式生产，赖氨酸盐酸盐熔点为263℃，口服半致死量（LD₅₀）为4.0g/kg，其结构中含有α-氨基和ε-氨基，只有ε-氨基为游离状态时才能被机体利用，故具有游离ε-氨基的赖氨酸称为有效赖氨酸。在提取时要注意避免有效赖氨酸破坏。

赖氨酸是合成脑神经、生物细胞核蛋白及血红蛋白不可或缺的营养成分，可缓解因赖氨酸缺乏产生的功能性障碍和蛋白质代谢不良等症状，若缺乏会导致机体其他氨基酸利用效率的降低，广泛应用于食品、药品以及饲料等工业中；也可作为营养补充剂用于医药领域，对外伤、烙伤、手术病人的康复有非常好的效果；赖氨酸还可作为利尿剂的辅助药物，治疗因血中氯化物减少而引起铅中毒的现象，与酸性药物（如水杨酸）联用生成盐类来减轻不良反应。

（二）L-赖氨酸的生产方法

1952年，日本味之素公司对大豆蛋白进行水解获得了赖氨酸并实现工业化生产，同年，日本中山等人以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）为出发菌株，经多级诱变处理获得了赖氨酸工业化规模的生产菌，最先实现发酵法工业规模生产。1956年，谷氨酸棒杆菌从土壤中被分离出来并用于谷氨酸的生产，随后又被用于赖氨酸的生产。微生物发酵法也因此成为赖氨酸制备的重要工业生产方法，赖氨酸工业已成为仅次于谷氨酸的第二大氨基酸工业。以下介绍蛋白质水解法、直接发酵法、酶促法和化学合成法等L-赖氨酸的生产方法。

1．蛋白质水解法

蛋白质水解法常以血粉或乳酪素为原料，用25%H₂SO₄进行酸解，并用石灰进行中和，过滤去渣。滤液真空浓缩，过滤除去不溶解的中性氨基酸，在热滤液中加入苦味酸，冷却至5℃，保温12～16h，析出L-赖氨酸苦味酸盐结晶。经冷水洗涤后，结晶用水重新溶解，加盐酸生成赖氨酸盐酸盐，滤去苦味酸，滤液浓缩结晶，得赖氨酸盐酸盐。

2．酶促法

酶促法是利用微生物产生的D-氨基己内酰胺外消旋酶使D-型氨基己内酰胺转化为L-型氨基己内酰胺，再经L-氨基己内酰胺水解酶作用生成L-赖氨酸。可产生D-氨基己内酰胺外消旋酶的常见微生物有奥贝无色杆菌（Achromobacter obae）、裂环无色杆菌（Achromobacter cycloclastes）、粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）等，可产生L-氨基己内酰胺水解酶的微生物有劳伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）、土壤假丝酵母、丝孢酵母（Trichosporon pullulans）等。

L-赖氨酸的酶促法制备工艺路线如图2-1-6所示。

将可产生D-氨基己内酰胺外消旋酶的无色杆菌和可产生L-氨基己内酰胺水解酶的隐球酵母混菌培养，可实现DL-氨基己内酰胺向L-Lys的转化，或用D-氨基己内酰胺消旋酶将D-氨基己内酰胺消旋化生成L-氨基己内酰胺，再用水解酶水解生成L-Lys，消旋酶来自裂环无色杆菌，水解酶来自隐球酵母。无色杆菌消旋酶的活力可保持约30h，酵母水解酶可以保持约100h，除使用干燥菌体外，也可以直接用培养液、菌体提取液进行反应，但要注意添加量。

赖氨酸酶促合成操作过程为：10% 100mL（78mmol/L）的DL-氨基己内酰胺（pH调节至8.0左右），加入0.1g隐球酵母的丙酮干燥菌体及0.1g无色杆菌冷冻干燥菌体，置于300mL的锥形瓶中，于40℃摇床培养24h。上清液中测不出氨基己内酰胺，L-赖氨酸的量为77.84mmol/L，转化率达到99.8%。加入少量活性炭进行脱色处理，搅拌并煮沸3min，冷却至室温，过滤后用HCl调pH为4.1，真空浓缩，60℃干燥得到L-赖氨酸盐酸盐，纯度为99.5%。

3．化学合成法

以己内酰胺为原料，得到外消旋赖氨酸，经拆分可得到L-赖氨酸。L-赖氨酸化学合成法工艺路线如图2-1-7所示。

4．直接发酵法

这是目前赖氨酸工业生产的主要方法。该方法是利用微生物的代谢调节突变株、营养要求性突变株（突变株的L-赖氨酸生物合成代谢部分或完全被解除），以淀粉水解糖、糖蜜、乙酸、乙醇等原料直接发酵生成L-赖氨酸。以下主要介绍微生物发酵法制备赖氨酸的生产工艺及过程质量控制。

赖氨酸发酵工艺流程如图2-1-8所示。

（1）种子扩大培养　赖氨酸生产菌的扩大培养常分为二级扩大培养，即一级摇瓶种子和二级种子罐培养，二级扩大培养后接入发酵罐进行发酵。种子扩大培养包括配料、灭菌、接种、培养、检测等操作步骤。

（2）赖氨酸发酵　赖氨酸发酵过程控制中控制培养基中生物素、L-苏氨酸和L-甲硫氨酸含量以及温度、pH、溶解氧（通风量、搅拌速度）等参数具有重要意义，特别是溶解氧控制。赖氨酸整个发酵过程分为菌体生长阶段和产物积累阶段，发酵时间以16～20h为分界线。发酵前期和发酵后期的培养温度一般为30～32℃和32～34℃，pH控制在6.5～7.5，最适pH为7.0，可通过补充尿素或氨水控制pH。二级种子培养接种量为2.5%，培养48h。由于赖氨酸生产菌大多是高丝氨酸营养缺陷型，苏氨酸和蛋氨酸含量丰富导致只长菌而不产赖氨酸，要控制苏氨酸和蛋氨酸在亚适量水平。赖氨酸生产菌为生物素缺陷型，培养基中需限量添加生物素。适量添加某些特定物质可促进赖氨酸的生物合成（表2-1-4）。

（3） L-赖氨酸的提取　发酵液中赖氨酸的提取工艺分为离子交换、真空浓缩、中和析晶、脱色重结晶和干燥等阶段（图2-1-9）。

① 准备　赖氨酸发酵结束后，将发酵液加热升温到80℃并保温约10min，灭菌并冷却。用HCl或H₂SO₄调节pH至2.0（若发酵液赖氨酸含量较高可适当稀释）。

② 进样　上柱液（含菌体）由树脂底部进料，至一定液面高度，并进行真空抖料（即柱阀关闭，由顶部抽真空并急开一口，使柱内树脂向上翻滚），待树脂全部分散均匀后进行反交换，料液不断从底部向上流动并连续流过离子交换树脂层，此过程树脂保持松动（称倒上柱或反吸附）。另一种上柱方式是将已灭活的发酵液用自动排渣高速离心机离心，除去菌体和固形物，上清液调pH并适当稀释后从树脂柱上部进料，自上而下连续流过离子交换树脂层（称正上柱或正吸附）。未经除菌处理的发酵液采取正上柱时，要在柱顶加压，防止菌体堵塞。

③ 注意事项　主要考虑流速、pH、赖氨酸浓度、结晶与脱色几个环节。

a．流速　吸附过程要注意上柱液的流速，一般每分钟流出体积约为树脂体积的1%，并随时监测流出液pH。待流出液pH下降至4.5时，不再洗脱，同时用茚三酮检测赖氨酸是否流出完全。离子交换完毕后，饱和树脂用水正相和反相冲洗，待树脂充分扩散、流出液澄清透明且pH呈中性时即清洗完毕。先用1mol/L氨水洗脱，当流出液pH达到8.0时，改用2mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程要控制洗脱速度，一般情况下，洗脱速度为每小时1倍树脂体积。洗脱过程若流出液流速过快，易出现洗脱高峰不集中，拖尾长，树脂中赖氨酸还未洗脱完全，pH就上升了，尾液中赖氨酸含量较高的情况。

b. pH与赖氨酸浓度　 洗脱过程中需连续监测流出液的pH及赖氨酸浓度的改变，常分为三个阶段洗脱液并分步收集，第一段为pH<9.0的流出部分，流出液中赖氨酸含量较低，可用作下批洗脱用氨水；第二段为pH 9.5～13.0流出液，其赖氨酸含量高，平均为6%～7%，流出高峰期可达到16%～20%，此段流出液是赖氨酸洗脱的主要阶段，为高含量区段，常直接送真空浓缩工段进行结晶浓缩；第三段为上段收集洗脱液的尾流部分，赖氨酸含量较低且铵离子量较高，可重新上柱洗脱或用作下批洗脱氨水之用。赖氨酸在进行离子交换时，常采取多柱串联离子交换（multiple-column series ion exchange，MCSIE），MCSIE可提高约5%的收率。在分段洗脱时，第三段洗脱液中赖氨酸含量较低，但铵离子浓度较高，因此，需采取减压浓缩除氨，从而提高单位体积的赖氨酸浓度，可采取中央循环管蒸发器、膜式蒸发器及双效或三效蒸发器。在浓缩操作前需将物料用酸调节pH至8.0，真空浓缩温度60～65℃，真空度8.6×10⁴Pa以上。物料经浓缩达到22°Bé（其中赖氨酸含量约90%）。氨回收装置与蒸发器相连，在浓缩过程中，回收淡氨水。

c．结晶　浓缩罐放入中和罐，在搅拌条件下加入工业盐酸将料液pH调节至4.8。然后，放料液至结晶罐进行析晶，在罐夹套内通过冷却水缓慢冷却物料，使冷却面与液体间温度差小于10℃，温差不要过大，否则冷却面溶液因产生局部过饱和而结晶析出，并沉积在结晶罐内壁。物料降至10℃并保温结晶10～12h。在结晶过程中，要注意适当搅拌以促进结晶进程，使晶体与母液充分搅拌并有利于晶体的均匀长大。结晶罐底部装配的锚式搅拌器以10～20r/min低速搅拌，以加速晶体结晶析出。析出的晶体通过离心操作可获得带一个结晶水的赖氨酸盐酸盐粗产品。

d．脱色　将带有一个结晶水的赖氨酸盐酸盐粗品用2.5～3.0倍去离子水溶解（赖氨酸含量为30%～35%），然后用活性炭进行脱色，活性炭用量一般为赖氨酸盐酸盐粗品的3%～5%（以赖氨酸质量为基准计算），活性炭用量可根据产品色泽进行合理选用，注意脱色温度和脱色时间等因素的影响。一般情况下，脱色温度为70～80℃，脱色时间为1～2h。完成脱色后立即用板框压滤机过滤并用水洗涤，合并滤液和洗涤液，真空浓缩至22°Bé，冷却，结晶。纯化后的赖氨酸盐酸盐晶体用真空干燥或热风干燥或红外干燥，于60℃干燥至水分含量≤0.1%。

（三）L-赖氨酸的质量控制

对产品进行质量分析，药用级、食用级和饲用级L-赖氨酸质量标准如表2-1-5所示。