生物标志物与非小细胞肺癌临床诊疗

陆舜　虞永峰

上海交通大学附属胸科医院

基于不同驱动基因和病理特征等生物标志物，可将非小细胞肺癌（NSCLC）分成不同的亚型。生物标志物在非小细胞肺癌临床诊疗的发展历程中发挥了越来越重要的作用（图1）。EGFR TKI药物（吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼和阿法替尼）对于EGFR基因敏感突变NSCLC，或ALK抑制剂（克唑替尼和Ceritinib）对于EML4-ALK融合基因阳性NSCLC的缓解率可达60%~70%，疾病控制率可达85%~95%，这些药物能使具有特征性生物标志物患者的无疾病进展生存期（PFS）达到9至14个月，总生存期（OS）可达30个月左右。因此，基于生物标志物的个体化治疗正在深刻地改变着非小细胞肺癌的临床诊疗（图2）。

生物标志物与EGFR、ALK抑制剂的靶向治疗

以IPASS、WJTOG3405、NEJSG002、OPTIMAL、EURTAC、 ENSURE和LUX-LUNG3等多项大样本随机临床研究结果为依据，美国国家综合癌症网络（NCCN）指南指出在一线治疗开始前，建议非鳞以及不吸烟的鳞癌患者接受EGFR突变状态的检查，如在一线化疗前发现EGFR突变，则建议进行一线EGFR-TKI治疗，如在一线化疗过程中发现EGFR 突变，可以进行EGFR-TKI 的维持治疗，或者在化疗过程中加用EGFRTKI 药物治疗。两项大型Ⅲ期临床研究（LUX-Lung3和LUXLung6）数据的汇总分析结果，证实第二代EGFR-TKI阿法替尼在EGFR敏感突变（尤其外显子19缺失突变）NSCLC一线治疗中具有重要地位。

EML4-ALK融合基因是具有致瘤性的变异基因。克唑替尼可用于治存在EML4-ALK融合基因的NSCLC，是美国FDA第一个批准进行Ⅲ期临床实验的ALK酪氨酸激酶受体抑制剂，并于2011年8月获得美国FDA批准用于晚期NSCLC的治疗，并于2013年2月被中国国家食品药品监督局（CFDA）批准用于晚期NSCLC治疗。新一代ALK抑制剂Ceritinib也于2014年4月被美国FDA批准用于治疗ALK-EML4融合基因阳性的晚期NSCLC。

生物标志物与EGFR、ALK抑制剂耐药

不论是EGFR-TKI药物治疗，还是ALK抑制剂治疗都会发生耐药，包括药物靶基因的改变（耐药突变、选择性剪切或基因扩增）和旁路信号通路激活。明确引起耐药的特定生物标志物是临床诊疗中克服耐药的关键［1］。

EGFR-TKI获得性耐药的原因大部分是由于EGFR酪氨酸激酶结构域的二次突变，T790M“守门人”突变占EGFR TKI获得性耐药原因的60%，它能干扰抑制剂与EGFR结合，并降低EGFR与ATP的亲和力［2］。与之相反，二次突变仅占克唑替尼获得性耐药原因的三分之一，并且耐药突变可以发生在ALK酪氨酸结构域的不同部位，数目较多。ALK的L1196M突变类似于EGFR的“守门人”突变，但是它仅占克唑替尼获得性耐药原因的一小部分（<20%）［3］。

在获得性耐药中，旁路信号通路激活具有显著的异质性。HER2基因扩增、MET基因扩增、PIK3CA突变、BRAF突变、NF1缺失和AXL上调等通过旁路激活，可导致EGFR TKI获得性耐药。其他导致EGFR-TKI耐药的原因包括，基因多态性导致凋亡阻滞、BIM异构体缺乏BH3促凋亡结构域、CRIPTO1过表达和上皮间质转化（EMT）。EGFR信号激活、KIT基因扩增、KRAS突变和IGF-1信号通路激活等，可导致ALK抑制剂获得性耐药。与二次突变耐药相比较，旁路信号通路激活在临床诊疗中更难处理，它可能需要TKI药物联合运用，会产生毒性“叠加”效应，和最佳剂量选择等问题。对于二次突变耐药，可以通过新一代具有不同作用机制的抑制剂来克服耐药。同一肿瘤也存在多重耐药的可能。因此，临床诊疗中需要判断是否存在两种或两种以上耐药机制，是否需要药物联合运用来抑制其主要耐药通路。另外，尽管部分患者存在特征性生物标志物，但是不能从相应的靶向药物治疗中获益，属于原发耐药，需要进一步研究和探索。

仅通过一般的临床和病理特征分析是无法明确患者的耐药原因的。因此，需要在治疗前、治疗后以及疾病进展时，明确肿瘤生物标志物的状态或变化，以便采取正确合理的治疗策略。这需要对同一肿瘤进行多次活检。另有一种方法是通过活检标本中肿瘤细胞的体外培养，明确耐药机制，确定有效治疗药物。但是，运用目前已有的细胞培养方法不能对所有的肿瘤样本均建立体外细胞系，并且该过程需要2~6个月，耗时较长，不利于临床治疗决策的及时作出。因此，需要进一步完善方法，以利于建立基于生物标志物的能克服获得性耐药个体化治疗。

其他驱动基因标志物

目前大部分已知驱动基因生物标志物的肺癌亚型均仅占NSCLC的一小部分，因为非小细胞肺癌患者人群庞大，其实每一部分亚型的患者实际人数仍然巨大。因此，全面的检测已知的罕见驱动基因有利于建立基于这些生物标志物特征的个体化精准治疗。目前已有多项大样本的多中心临床研究正在进行，探索这些相对低频的生物标志物在NSCLC治疗中的价值。非小细胞肺癌生物标志物的发生频度、治疗药物和标志物检测方法，见表1。以生物标志物（EGFR和ALK基因外）为靶点的在研NSCLC临床试验，见表2。

ROS1基因位于染色体6q22，用于编码胰岛素样受体相关的跨膜酪氨酸激酶受体，ROS1可以与CD74、SLC34A2/ NaPi2b或 FIG9发生基因融合。ROS1融合基因阳性约占NSCLC的1%~2%。年轻不吸烟的腺癌患者更易发生ROS1阳性。在一项50例ROS1阳性晚期NSCLC患者入组的Ⅰ期临床研究中，患者接受克唑替尼（抑制ROS1、MET和ALK）治疗，缓解率可达72%，无疾病进展生存期（PFS）达到19.2个月［4］。

RET基因位于染色体10q11.2，用于编码神经嵴发育相关的酪氨酸激酶受体，RET可与KIF5B等数种配体基因发生融合形成融合基因，激活RET通路，如KIF5B-RET、CCDC6-RET、NCOA4-RET和TRIM33-RET2，其中KIF5B-RET是最常见的类型。RET融合基因阳性约占肺腺癌的1%~2%。RET阳性更多见于年轻、不吸烟的低分化肺腺癌患者。Ⅱ期临床研究发现Cabozantinib对RET阳性的晚期NSCLC有治疗疗效［5］。

BRAF基因编码KRAS的下游的丝氨酸/苏氨酸效应蛋白，它可以激活MAPK信号转导，调控细胞增殖。与黑色素瘤不同，在NSCLC中约有50%的BRAF突变属于非V600E突变，如L596R和G468A突变。目前关于V600E突变是“驱动突变”，其他突变属于伴随的“乘客突变”仍存在争议。研究发现V600E突变多见于不吸烟的女性患者，而非V600E突变多见于吸烟患者。已有研究报道Vermurafinib对BRAF突变阳性NSCLC治疗有效。

MET基因位于染色体7q21-q31，用于编码肝细胞生长因子（HGF）相关跨膜酪氨酸激酶受体。MET基因扩增占NSCLC的1%~11%，鳞癌比腺癌更常见。MET基因扩增可以激活PI3K/AKT信号通路。它是EGFR基因敏感突变者接受EGFR-TKI治疗后发生获得性耐药的一个重要原因。目前在研的作用于MET/HGF信号通路的药物包括：克唑替尼、Cabozantinib和 Rilotumumab。

HER2基因属于HER酪氨酸受体家族的一员，HER2突变主要出现20外显子，约占NSCLC患者的1%~2%，常见于不吸烟的女性患者。有报道发现HER2突变阳性的肺腺癌患者接受阿法替尼和曲妥单抗治疗有效［6］。

FGFR1是一种膜结合的酪氨酸激酶受体，通过MAPK 和PI3K信号通路调控细胞增殖和血管新生。FGFR1基因扩增在肺鳞癌（21%）的发生率较肺腺癌（3%）更高。新一代的FGFR抑制剂Ponatinib对FGFR1过表达的患者可能有效。

PIK3CA基因编码PI3K蛋白，它是重要的细胞内脂质激酶和催化亚基。PIK3CA基因突变最常发生于调控催化亚基结构域的部位，约占NSCLC的1%~3%，更易发生于肺鳞癌患者。研究PI3K抑制剂与化疗联合治疗NSCLC的临床试验正在进行。

PTEN基因位于10号染色体，编码脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶，通过负向调控PI3K/AKT信号通路，进而影响细胞的凋亡、增殖、迁移。肺鳞癌细胞更易出现PTEN基因和PTEN蛋白表达缺失。在体外研究中发现，Vandetanib对PTEN蛋白表达缺失的EGFR野生型肺癌细胞株有明显的抑制生长的作用。

DDR2基因编码与胶原蛋白结合的酪氨酸激酶膜受体，可调控细胞的生长和增殖。DDR2基因突变约占肺鳞癌的3.8%。有研究提示，Dasatinib对DDR2基因突变者有治疗疗效。

生物标志物与肺鳞癌

二十年前肺鳞癌是最常见的肺癌病理类型，但是其发病率逐年下降，目前约占非小细胞肺癌的20%~30%。在治疗进展方面，肺鳞癌已远远落后于肺腺癌。其中一个重要原因是，目前已知的能帮助制定临床治疗决策的驱动基因标志物太少。NCCN及ESMO指南都不推荐肺鳞癌标本进行生物标志物检测（除小活检标本、不吸烟者或存在混合病理类型者）。目前肺鳞癌的靶向治疗确实面临一个困境和挑战，由于存在较大的肺出血风险，贝伐单抗不被推荐用于肺鳞癌，由于经济效用方面的考量，西妥昔单抗用于肺鳞癌亦受到一定的限制。但近期的研究也带来一丝曙光，来自1093例晚期肺鳞癌一线治疗的随机研究提示，RGFR单抗necitumumab联合GP方案（吉西他滨/顺铂）较单用GP方案，总生存期从9.9个月提高到11.5个月（P=0.012）。来自1253例晚期NSCLC二线治疗的随机研究提示，VEGFR2单抗ramucirumab联合多西他赛较单用多西他赛，总生存期从9.1个月提高到10.5个月（P=0.023），该研究中每个随机组中均有约四分之一的肺鳞癌患者［7］。目前基于生物标志物的肺鳞癌临床研究见表3。

Lung-MAP研究是一项近期启动的大型临床研究，目的在于建立基于驱动生物标志物的晚期肺鳞癌二线治疗策略。该研究计划对肺鳞癌标本检测200个肿瘤相关基因。以此为基础，将患者分为5个治疗组别，与目前肺鳞癌的标准二线治疗（多西他赛和厄洛替尼）比较。每个组别每年计划入组400~800例患者。目前已知的干预药物包括：PD-1单抗MEDI4736、FGFR酪氨酸酶抑制剂AZD4547、HGF单抗Rilotumumab、PI3K抑制剂Taselisib、CDK4/6抑制剂Palbociclib［8］。

生物标志物与免疫治疗

肺癌的免疫逃避机制限制了肺癌免疫治疗的疗效。近期免疫检查点抑制剂的问世有望改善肺癌免疫治疗的困境。包括T细胞在内的免疫细胞在细胞膜上表达免疫检查点蛋白，它可以通过促进或抑制免疫细胞内信号转导来调控免疫细胞对抗原的反应。肿瘤细胞可以通过其表达的PDL-1与T细胞表达的PD-1结合，从而逃避T细胞的免疫监控。阻断PD-1-PD-L1通路的临床研究提示，约20%的NSCLC患者获得缓解，且这部分患者疗效持久，生存期显著延长。来之272例复治晚期肺鳞癌的随机临床研究发现，PD-1单抗nivolumab与多西他赛比较，前者可以延长总生存期3.2个月［9，10］。

哪些患者最易从免疫检查点抑制剂治疗中获益？Nivolumab治疗的早期临床研究发现，PDL-1表达阳性的25例中有9例获得缓解（36%），而17例PDL-1表达阴性的17例患者没有一例出现缓解（P=0.006）。Herbst等发现接受PDL-1单抗治疗的53例NSCLC患者中，肿瘤细胞PDL-1高表达与治疗缓解率间有密切的相关性（P=0.015）。目前研究发现鳞癌和非鳞癌均能从免疫检查点抑制剂治疗中获益，吸烟患者可能较非吸烟患者更有效。EGFR通路激活可以诱导PDL-1表达，对手术切除的标本检测发现，EGFR敏感突变者较EGFR野生型者更易出现PDL-1高表达。Justin等在2015 年ASCO报道的研究发现，在一部分患者中PD-L1表达是动态变化的，在EGFR突变患者中，TKI治疗前和TKI治疗后耐药的活检组织中，PD-L1表达状态在22%患者中发生了变化，在ALK重排患者中，克唑替尼治疗前和治疗后的活检组织中，PD-L1表达状态在25%患者中发生了变化。在临床诊疗中需要明确哪些肿瘤处于PDL-1高表达状态，可能从相关治疗中获益。因此，建立统一的标准化化检测方法对于非小细胞肺癌免疫治疗十分重要和迫切。

前景和展望

在过去的十年中，基于驱动基因标志物的靶向治疗和免疫检查点抑制剂治疗使非小细胞肺癌的临床诊疗水平有了巨大的提高。但每种治疗方法均有各自的优缺点。基于驱动基因标志物的靶向治疗具有较高的缓解率，但疗效持续时间相对较短，而免疫检查点抑制剂治疗的缓解率较低，但疗效的持续时间较长［11］。

目前对于肿瘤科临床医生最大的挑战是需要明确每位患者是否具有特征性生物标志物，它们是哪些生物标志物，是否能从针对这些生物标志物靶点的治疗中获益。生物标志物在未来晚期NSCLC诊疗临床实践中的作用，见图3。另外，在临床中如何选择给予靶向治疗、免疫治疗和化疗的最佳时间点以及治疗顺序，也是需要进一步深入研究的课题。

参考文献

1. Crystal AS，Shaw AT，Sequist LV，et al. Patient-derived models of acquired resistance can identify effective drug combinations for cancer. Science，2014，346：1480-1486.

2. Janjigian YY，Smit EF，Groen HJ，et al. Dual inhibition of EGFR with afatinib and cetuximab in kinase inhibitor-resistant EGFR-mutant lung cancer with and without T790M mutations. Cancer Discov，2014，4：1036-1045.

3. Katayama R，Friboulet L，Koike S，et al. Two novel ALK mutations mediate acquired resistance to the next-generation ALK inhibitor alectinib. Clin Cancer Res，2014，20：5686-5696.

4. Shaw AT，Ou SH. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. N. Engl. J. Med，2014，371：1963-1971.

5. Drilon A，Wang L，Hasanovic A，et al. Response to cabozantinib in patients with RET fusion-positive lung adenocarcinomas. Cancer Discov，2013，3，630-635.

6. Mazières J，Peters S，Lepage B，et al. Lung cancer that harbors an HER2 mutation：epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives. J Clin Oncol，2013，31（16）：1997-2003.

7. Garon EB，Ciuleanu TE2，Arrieta O，et al. Ramucirumab plus docetaxel versus placebo plus docetaxel for second-line treatment of stage IV non-small-cell lung cancer after disease progression on platinum-based therapy （REVEL）：a multicentre，doubleblind，randomised phase 3 trial. Lancet，2014，384：665-673.

8. Malik SM，Pazdur R，Abrams JS，et al. Consensus report of a joint NCI thoracic malignancies steering committee：FDA workshop on strategies for integrating biomarkers into clinical development of new therapies for lung cancer leading to the inception of “master protocols” in lung cancer. J Thorac Oncol，2014，9：1443-1448.

9. Herbst RS，Soria JC，Kowanetz M，et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature，2014，515：3563-3567.

10. Gettinger S，Herbst RS. B7-H1/PD-1 blockade therapy in nonsmall cell lung cancer：current status and future direction. Cancer J，2014，20：281-289.

11. Kris MG，Johnson BE，Berry LD，et al. Using multiplexed assays of oncogenic drivers in lung cancers to select targeted drugs. JAMA，2014，311：1998-2006.