第二节　革兰阴性菌耐药机制

细菌对抗菌药物的耐药性可分为天然耐药和获得性耐药，前者是指某一种属的细菌由于其结构和生理的特殊性而对某种抗菌药物固有耐药，如嗜麦芽窄食单胞菌对碳青霉烯类天然耐药；而获得性耐药则是由于细菌发生基因突变或获得外源性耐药基因所致。细菌可以通过产生灭活酶、改变抗菌药物作用靶位、降低外膜通透性或主动外排系统等多种机制获得耐药性。

一、 药物灭活酶的产生

细菌可产生多种灭活酶作用于抗菌药物，使其失去抗菌活性。革兰阴性菌常见的灭活酶包括：β-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶和甲基化酶等。

革兰阴性菌对β-内酰胺类药物最主要的耐药机制是产生多种β-内酰胺酶，它可与药物分子结构中的β-内酰胺环结合并使之打开，从而使抗菌药物失活。目前已发现1000多种β-内酰胺酶，主要采用两种分类方法：Ambler和Bush-Jacoby分类。Ambler分类根据氨基酸序列，将β-内酰胺酶分为A、B、C、D四类。其中A、C、D类为丝氨酸β-内酰胺酶，B类酶因需要二价金属离子（Zn²⁺）才能发挥活性，故又称为金属酶。Bush分类则根据β-内酰胺酶的功能将其分为1群头孢菌素酶、2群青霉素酶、3群金属酶和4群未知酶。随着β-内酰胺类的广泛使用，β-内酰胺酶的种类不断增加，其中最重要的是超广谱β-内酰胺酶（extendedspectrum β-lactamases，ESBLs）、AmpC型酶和碳青霉烯酶等。革兰阴性菌临床株产生的重要β-内酰胺酶见表1-1。

表1-1　临床革兰阴性菌产生的主要β-内酰胺酶

续表

ESBLs由大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等革兰阴性菌产生，能够水解青霉素类、头孢菌素类和单环类抗生素，但不能水解碳青霉烯类和头霉素类，其活性可被酶抑制剂抑制。2000年以前，ESBLs以TEM型和SHV型为主，多见于引起医院感染的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。2000年后，CTX-M型ESBLs在全球广泛传播，成为肠杆菌科细菌ESBLs最主要的类型。社区获得性大肠埃希菌产CTX-M（特别是CTX-M-15）的报道也显著增加。

AmpC酶由染色体或质粒介导，除沙门菌属、普通变形杆菌、奇异变形杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌外，几乎所有的革兰阴性杆菌均可或多或少地产生染色体介导AmpC酶，且最常见于阴沟肠杆菌等肠杆菌属细菌。AmpC酶能够水解头孢菌素类（包括超广谱头孢菌素）和青霉素类，不能水解第四代头孢菌素和碳青霉烯类，且耐受克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等酶抑制剂。质粒介导的AmpC型β-内酰胺酶主要包括CMY、FOX、MOX、LAT、MIR和ACT等，国际上以CMY型多见，我国则以DHA型和ACT型为主。

碳青霉烯类是治疗其他β-内酰胺类耐药的革兰阴性菌的最后一道防线，而碳青霉烯酶的出现无疑给临床治疗带来了巨大挑战。碳青霉烯酶能水解碳青霉烯类（如厄他培南、亚胺培南和美罗培南），以及其他β-内酰胺类抗生素，包括青霉素、头孢菌素和β-内酰胺酶抑制剂等。更为严重的是，携带质粒介导碳青霉烯酶耐药菌存在潜在暴发的危险。临床常见的碳青霉烯酶包括Ambler A类（如KPC）、Ambler B类（如NDM、IMP、VIM等）和Ambler D类（如OXA-48、OXA-23和OXA-51等）。

2004年，我国浙江地区首次分离出KPC阳性的肺炎克雷伯菌，自此产KPC肠杆菌科细菌在国内开始流行。KPC-2是国内最常见的碳青霉烯酶，多见于肺炎克雷伯菌。国际上bla_KPC-3基因常在肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌中检出，而我国仅在大肠埃希菌和弗劳地枸橼酸杆菌中检测出该基因。

临床上较为常见的金属β-内酰胺酶为IMP、VIM、SPM和NDM。我国最先报道的金属β-内酰胺酶为IMP-4，存在于杨氏枸橼酸杆菌（Citrobacter youngae）和不动菌属，随后在克雷伯菌属中也有检出。VIM-2是我国不同医院铜绿假单胞菌中检测出的唯一一种VIM型金属β-内酰胺酶。2009年Yong等首次发现新德里金属β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamases，NDM），该酶现已迅速波及全球多个国家和地区。NDM几乎可以水解所有的β-内酰胺类，大多由肠杆菌科细菌和不动杆菌属产生，特别是肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。编码NDM-1的基因常位于质粒上，具有迅速水平传播的能力，可能会导致多重耐药株的蔓延。

OXA酶主要见于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，而肠杆菌科中较少见。我国鲍曼不动杆菌中以OXA-23最为常见。大多数获得性OXA酶基因位于质粒整合子上，具有快速变异和广泛传播的能力。虽然OXA酶水解碳青霉烯类的能力较弱，但它能与外排系统和孔蛋白共同作用，造成碳青霉烯类耐药。

氨基糖苷类钝化酶（aminoglycoside modifying enzymes，AMEs）是细菌对氨基糖苷类耐药的最重要原因。AMEs来源于某些细菌正常呼吸所需要的酶，主要包括三类：氨基糖苷磷酸转移酶（aminoglycoside phosphotransferase，APH）、氨基糖苷核苷酸转移酶（aminoglycoside nucleotidyltransferase，ANT），以及氨基糖苷乙酰转移酶（aminoglycoside acetyltransferase，AAC）。这些钝化酶共价修饰抗菌药物的氨基或羟基，使氨基糖苷类与核糖体不能紧密结合，从而无法发挥抗菌作用。AMEs可通过可移动元件在细菌间传播，耐药基因常由整合子携带。

16S rRNA甲基化酶是肠杆菌科、铜绿假单胞菌和不动杆菌属对氨基糖苷类耐药的重要机制之一。16S rRNA甲基化酶能够作用于氨基糖苷类的靶位而导致细菌对几乎所有氨基糖苷类高水平耐药。已报道的16S rRNA甲基化酶基因包括：armA、rmtB、rmtC和rmtD等，国内临床分离株主要检测到armA及rmtB。这些基因多位于质粒的转座子上，并广泛存在于革兰阴性杆菌中，为耐药基因在细菌间的播散提供条件。

二、 抗菌药物作用靶位改变

由于抗菌药物作用靶点较特异，因此靶位的任何微小改变都将显著影响抗菌药物的结合。例如，β-内酰胺类的作用靶点是青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs），细菌通过改变PBPs的结构降低β-内酰胺类抗菌药物与其的亲和力，产生耐药性。与革兰阳性菌相比，革兰阴性菌中由PBPs改变引起的耐药较少见，主要为流感嗜血杆菌和淋病奈瑟菌。

喹诺酮类是治疗医院和社区感染最常使用的抗菌药物之一，它能够直接抑制细菌DNA的合成，作用靶位为两种拓扑异构酶，即DNA旋转酶（属于Ⅱ型拓扑异构酶）和Ⅳ型拓扑异构酶。前者由GyrA和GyrB两种亚基组成，后者由ParC和ParE组成。喹诺酮类药物靶位改变引起的耐药性由染色体介导。大多数高水平耐药临床菌株存在拓扑异构酶突变，且GyrA和ParC常存在不止一个突变位点。而GyrB和ParE的突变较少见。在革兰阴性菌中，质粒介导的氟喹诺酮类耐药由靶位保护蛋白Qnr、灭活酶Aac-6′-Ib-cr及外排泵OqxAB和QepA引起，尽管耐药水平较低，但它可与其他耐药机制共同起作用，使细菌产生高水平耐药。这些耐药基因位于质粒上，可使喹诺酮类耐药性在菌株间广泛传播。

三、 细菌外膜通透性改变

革兰阴性菌的细胞外膜上存在多种孔蛋白，是营养物质和亲水性抗菌药物的通道。孔蛋白表达下降、类型转换或结构突变均能够减少抗菌药物进入细菌细胞内，影响药物的敏感性，进而产生耐药。β-内酰胺类抗菌药物的敏感性与肠杆菌科细菌的非特异性孔蛋白OmpC和OmpF亚类存在密切相关。细菌产生钝化酶，同时联合孔蛋白缺失可影响其耐药表型。研究显示细菌产ESBLs或AmpC酶联合孔道蛋白缺失，是导致肠杆菌科细菌对碳青霉烯类中高水平耐药的常见原因。

四、 细菌外排系统的作用

主动外排系统也是革兰阴性菌多重耐药的重要机制之一。根据氨基酸序列的同源性，可将外排泵主要分为5个超家族，包括RND家族、MFS家族、MATE家族、SMR家族和ABC家族，其中以RND家族最为常见。铜绿假单胞菌的外排泵包括MexAB-OprM、MexCDOprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM等。鲍曼不动杆菌中也存在不同类型的RND外排系统，如AdeABC、AdeDE、AdeFGH和AdeIJK等，这些系统能够降低氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素和氯霉素的敏感性。AcrAB-TolC是肠杆菌科细菌最主要的外排泵，其过度表达与抗菌药物的多重耐药性有关。一项对医院中氟喹诺酮类耐药大肠埃希菌的研究表明，菌株的多重耐药情况越严重，其AcrAB基因高表达的可能性也越大；同时，多重耐药株均对氟喹诺酮类不敏感，提示氟喹诺酮类耐药与多重耐药存在潜在联系，AcrAB高表达可能将成为细菌多重耐药的生物标记。