【必备知识】

一、光学显微镜的基本构造

光学显微镜的构造见图2-1。

1．机械部分

（1）镜座　镜座位于显微镜底部，呈马蹄形，它支持全镜。

（2）镜臂　位于镜筒的后面，为弓形，为支持镜筒和搬移显微镜时握持部位。镜臂有固定式和活动式两种，活动式的镜臂可改变角度。

（3）镜筒　位于显微镜的前上方，上接目镜，下接转换器。有单筒和双筒两种，双筒上端有两个目镜，使用时眼睛不易疲劳。

（4）物镜转换器　位于镜筒下方，为两个金属碟所合成的一个转盘，其上有4～6个圆孔，可装配不同放大率的物镜。为了使用方便，物镜应按低倍到高倍的顺序安装。转换物镜时，必须用手按住圆盘旋转，勿用手指直接推进物镜，以防物镜和转换器间螺旋松脱而损坏显微镜。每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。

（5）载物台　位于镜筒的下方，中央有一孔，为光线通路，台面上装有一对压片夹，或推进器，其作用是推动和固定标本的位置，使镜检标本恰好位于视野的中心。

（6）调焦装置　调焦装置即安装在镜臂基部两侧的粗动手轮和微动手轮，是用于调节物镜和标本间距离的部件，利用它们使镜台或镜筒上下移动，当物体在物镜和目镜焦点时，则得到清晰的图像。在用粗动手轮未找到物像前，不要使用微动手轮，以免磨损微动手轮。

2．光学部分

（1）物镜　物镜是安装在镜筒下端转换器上的接物透镜。其作用是将物体第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。

物镜的种类很多，可从不同角度来分类：根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：

① 干燥系物镜　以空气为介质，如常用的40×以下的物镜，数值孔径均小于1。

② 油浸系物镜　常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90～100，数值孔径大于1。

物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical aperture，NA），每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。

物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、所用盖玻片的最大厚度（mm）等主要参数（图2-2）。如NA 0.25，10×，160/0.17，其中“NA 0.25”表示数值孔径；“10×”表示放大倍数为低倍，“40×”表示放大倍数为高倍，“100×”表示油镜；“160/0.17”分别表示镜筒机械长度和所用盖玻片的最大厚度（mm）。一般放大倍数小者，镜头较短，镜片口径大；放大倍数大者，镜头较长，镜片口径小。

（2）目镜　目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，不增加分辨力，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。上面一般标有5×、10×、15×等放大倍数，可根据需要选用。

（3）聚光器　聚光器起汇聚光线的作用，可上下移动。当用低倍镜时聚光器应下降，当用油镜时聚光器应升到最高位置。在聚光器的下方安装有可变光阑（光圈），它由十几张金属薄片组成，可放大和缩小，用以调节光强度和数值孔径的大小。在观察较透明的标本时，光圈宜缩小些，这时分辨率虽降低，但反差增强，从而使透明的标本看得更清楚。但也不宜将光圈关得太小，以免光干涉现象而导致成像模糊。

（4）光源　较新型的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内，通过按钮开关来控制；老式的显微镜大多采用外置在镜座上的反光镜收集光源，有的显微镜两者兼有。反光镜的一面是平面镜，另一面是凹面镜，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜并调节其角度，使视野内光线均匀，亮度适宜。

二、微生物分类及形态特征

（一）概述

1．微生物的概念

微生物不是生物分类学中的名词，而是指所有形体微小，具有单细胞或简单多细胞结构，或没有细胞结构的一群低等生物的总称。微生物个体微小，小到必须用微米（μm，即10－6m）级甚至纳米（nm，即10－9m）级来作计量单位。大多数需借助光学显微镜或电子显微镜才能观察到。只有少数微生物如地衣、低等藻类、大型食用真菌用普通肉眼能观察到。

2．微生物的特点

① 种类繁多，分布广泛。

② 个体体积微小，结构简单。

③ 代谢能力强，繁殖速度快。

④ 适应性强。

⑤ 受环境影响大，变异快。

3．微生物的分类

根据微生物的大小、结构和组成不同可分为三大类型（表2-1）：非细胞型微生物、原核细胞型微生物、真核细胞型微生物。

4．微生物的分类单位

微生物的分类单位（表2-2）和其他生物的分类单位一样，都是门、纲、目、科、属、种。性质相似、相互有关的种组成属，相近似的属合并为科，近似的科合并为目，近似的目归纳为纲，综合各纲成为门，由此构成一个完整的分类系统。在两个主要分类单位之间，可添加亚门、亚纲、亚科、亚属。

5．微生物与医药学的关系

微生物与医药学的关系特别密切，微生物的发展极大地促进了医药学的发展。许多微生物或微生物产品就是药品，可直接用于临床，如马勃、灵芝、猴头、冬虫夏草等真菌；另外，可用微生物生产药品，如利用青霉菌生产青霉素，利用大肠埃希菌、酵母菌生产胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等细胞因子；微生物还可以生产预防传染病的菌苗、疫苗、类毒素的抗毒素。现在微生物在多糖领域、微生物免疫制剂、酶抑制剂、微生物毒素药物等方面都有广泛的应用，其发展前景也更加广阔。

微生物与药品生产也有密切的关系，不同制剂的药品生产环境对微生物的限度有不同的要求，为了防止药品在生产过程中被污染，国家对各种药品生产的操作过程都有严格的规定，2015年版《中国药典》中对所有上市的药品都有严格的检验标准，微生物检验是一项重要的内容，国家不仅对各种药品制剂的微生物检验项目有了明确的规定，而且对微生物检验的方法及所用设备、材料、设备材料的检验也做了明确规定；微生物与药品的储藏也有很大的关系。

（二）微生物的形态特征

1．细菌

细菌是单细胞原核微生物，个体微小，结构简单，进行二分裂繁殖。在一定的环境条件下，其经常保持着一定的形态。细菌具有三种基本形态：球状、杆状、螺旋状，分别称为球菌、杆菌和螺旋菌（图2-3）。

细菌的形态与环境条件和菌龄有关。当菌体细胞衰老或环境条件不适宜时，如养分缺乏、自身代谢产物积累过多、温度过高、培养基中含有抗生素、过高的盐分等，细菌常表现出不正常的形态。表现为多形性，或呈梨状、丝状。

细菌的长度单位常用微米，细菌的大小差别很大，但一般不超过几个微米。球菌的大小以其直径表示，杆菌、螺旋菌的大小以长度宽度表示。螺旋菌以其自然弯曲的长度来计算。

（1）球菌　球形或近似球形的细菌，大多数球菌的直径为0.8～1.2μm，按其分裂方向和分裂后的排列状态可分为以下几种（表2-3）。

（2）杆菌　杆状的细菌，一般长度为1～5μm，宽0.5～1.0μm，其细胞外形较球菌复杂。杆菌的长短、粗细差别很大。常有长杆菌、短杆菌；形如棒状的棒状杆菌（北京棒状杆菌），形如梭状的梭状杆菌（肉毒梭状芽孢杆菌）；有的呈分枝状（结核分枝杆菌），有的呈纺锤状；形成芽孢的称为芽孢杆菌。杆菌是细菌中种类最多的类型。大肠埃希菌俗称大肠杆菌，是人类肠道菌群的重要成员。细胞平均长度为2μm，宽0.5μm，菌体呈短杆状或长杆状，革兰染色阴性，多数有鞭毛，能运动，有菌毛，无芽孢，菌落呈白色或黄白色，光滑。

（3）螺旋菌　菌体弯曲呈螺旋状，根据其弯曲程度不同分为弧菌和螺菌。

① 弧菌　菌体略弯，螺旋不足一环，呈逗号状或弧状。如副溶血性弧菌。

② 螺菌　菌体回转如螺旋状、坚硬，螺旋满2～6环。如迂回螺菌。

2．真菌

真菌是微生物中种类最多的一大类，是真核细胞型微生物，真菌细胞由细胞壁、细胞核、细胞膜、细胞质组成，细胞核有分化完全的核膜、核仁、染色体。细胞壁成分主要为几丁质。因此，真菌多数对抗生素不敏感。多为发达的菌丝体组成（如霉菌），少数为单细胞（如酵母菌），寄生或腐生生活。

（1）霉菌　霉菌由菌丝体和孢子组成。霉菌大多数是多细胞的微生物，而且细胞已有功能上的分化。构成霉菌营养体的基本单位是菌丝，其直径通常为3～10μm，霉菌的菌丝有两种类型（图2-4）。

一种是菌丝中无隔膜的，整个菌丝体就是一个单细胞，含有多个细胞核，为低等真菌所具有的菌丝类型（如毛霉属和根霉属）（表2-4）；另一种是有隔膜的菌丝，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌丝体由多个细胞组成，为高等真菌所具有的菌丝类型（如青霉属和曲霉属）。

霉菌的菌丝可伸长并可产生分枝，许多分枝的菌丝相互交织在一起，称为菌丝体。固体培养基上霉菌的菌丝体在生理功能上有一定的分化（图2-5），深入到培养基内的菌丝，称为基内菌丝或营养菌丝。营养菌丝是伸入培养基内或匍匐生长于培养基表面的具有吸收营养物质和排泄代谢废物功能的菌丝。当营养菌丝发育到一定阶段，向空间长出的菌丝称为气生菌丝。气生菌丝中有一部分菌丝能形成生殖细胞或生殖细胞保护组织，故又称为繁殖菌丝。气生菌丝可形成各种形态的子实体，有些霉菌菌丝会产生色素，呈现不同的颜色，有的色素也可以分泌到细胞外。适应环境的需要，霉菌菌丝特化形成各种特殊的结构和组织（如吸器、假根、子座、菌核、匍匐菌丝、菌索等），具有各自的特殊功能。因此，霉菌呈现出不同的形态特征（图2-6）。

毛霉是一种较低等的真菌，菌丝体发达，像毛发一样很长，颜色为白色，故称之为毛霉，毛霉属真菌的菌丝无隔且多核，是单细胞真菌，有性孢子是接合孢子，无性孢子是孢囊孢子，孢囊梗直接由菌丝长出。毛霉属的代表种如高大毛霉，菌丝管状无隔且多核，气生菌丝单生，菌丝末端膨大形成孢子囊，囊内充满多核的原生质，发育出许多孢囊孢子。孢子囊以下的菌丝称为孢子梗，孢囊梗伸入囊内的部分称为囊轴。孢囊梗（30～70μm）直立，孢囊顶生，直径70～200μm，初始为黄色，后变灰褐色，孢子囊壁表面有刺（图2-7）。高大毛霉最大的特点就是菌丝高大。

毛霉的分布很广，会使各种食品、药品、纺织品、皮革等物品发霉变质。毛霉的用途广泛，能产生蛋白酶，具有强的蛋白分解能力，多用于制作腐乳、豆豉；有的可产生淀粉酶，工业上常用作糖化菌或用来生产淀粉酶，有些还用来生产柠檬酸、草酸等有机酸。

根霉与毛霉有许多相似处：菌丝无隔且多核，形成孢囊孢子，有性生殖为接合孢子。菌丝为白色，常呈絮状。

根霉属的代表匍枝根霉，由营养菌丝产生弧形的匍匐菌丝，向四周蔓延，匍匐菌丝是一种气生菌丝，向下产生丛生的假根，伸入培养基中吸收营养。由假根向相反方向伸出数根孢子囊梗，顶端膨大形成孢子囊，孢子囊呈球形（直径50～360μm），其内充满孢囊孢子，孢囊孢子近球形，表面有线状网纹，成熟后多呈黑色（图2-8）。

根霉的分布广泛，空气、土壤及各种器皿表面都存在，常见于淀粉类食品上，引起食物、水果、药品发霉变质。根霉的应用很多，因为它能产生一些酶类（淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等），是工业上有名的生产菌种。另外，在我国酿酒生产用根霉作糖化菌种已有悠久的历史，在乳酸、延胡索酸等有机酸的生产中被广泛利用。

曲霉菌丝有隔膜且多核，为多细胞丝状真菌。无性孢子为分生孢子，菌丝细胞特化成厚壁而膨大的足细胞，其上可垂直生出分生孢子梗。分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，一般呈球形或椭球形，顶囊表面辐射长出一层或两层杆状小梗，小梗顶端着生一串分生孢子，小梗顶端着生的分生孢子颜色有多样，绿、黄、橙、褐、黑等，是鉴别分类的重要依据。

曲霉属的代表黄曲霉、黑曲霉，菌丝发达多分枝，为有隔菌丝且多核的多细胞真菌，分生孢子梗（宽10～20μm，长400～1000μm）由特化了的菌丝细胞（足细胞）上垂直生出，顶端膨大呈球形或椭球形的顶囊（25～45μm），顶囊表面辐射长出一层或两层杆状小梗，小梗顶端着生一串分生孢子，整体形如“菊花”（图2-9）。

曲霉广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起谷物、食物、果蔬变质，有的可产生致癌的黄曲霉毒素。

曲霉在发酵工业和酿造工业上起着重要作用，曲霉是制酱、制醋、酿酒的主要菌种；用于蛋白酶、淀粉酶、果胶酶等酶制剂的生产；还用于柠檬酸、葡萄糖酸等有机酸的生产。

青霉菌丝与曲霉菌丝相似，菌丝也是有隔膜且多核的细胞，但无足细胞，分生孢子梗从基生菌丝或气生菌丝上生出，有横隔，分生孢子梗顶端不膨大，2～3次分枝，呈扫帚状分生孢子头（青霉穗），分生孢子梗往上依次称为梗基、小梗、分生孢子，排成链状。扫帚枝有单轮、双轮和多轮，对称或不对称。青霉的分生孢子呈球状或椭球状，生长时呈蓝绿色。

青霉属的青霉是产生抗生素的重要菌种，代表菌有产黄青霉、点青霉。菌丝为有隔菌丝且由多核的多细胞构成。分生孢子梗光滑（直径3～3.5μm），从基内菌丝或气生菌丝生出，有隔，2～3次分枝，梗基直径2～3μm，小梗轮生，直径2～2.5μm，分生孢子椭圆形，排成链状（图2-9）。

霉菌是丝状真菌的俗称，在潮湿的气候条件下，可在有机物上大量繁殖，从而引起食物、药材、工农业产品的霉变（表2-5）。

（2）酵母菌　酵母菌不是分类学上的名称，是一类非丝状真核微生物，是以出芽繁殖为主的单细胞真菌。多数酵母菌为单细胞，一般为卵圆形、圆形或圆柱形（图2-10）。酵母菌细胞具有细胞壁、细胞核、细胞膜、细胞质、液泡及线粒体等，细胞壁的主要成分是酵母多糖（葡聚糖和甘露糖）、几丁质、蛋白质等物质。酵母菌的细胞直径约为细菌的10倍，直径为3～5μm，长为5～30μm，酵母细胞的形状、大小即使在纯培养中也有差异。有些酵母细胞与其子细胞连在一起形成链状，形状与霉菌菌丝相似，称为假菌丝。如热带假菌丝酵母（图2-11）。

3．放线菌

放线菌是一类有丝状分枝的单细胞原核微生物，以孢子进行繁殖，无典型的细胞核，无核膜、核仁、线粒体等。分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤中，在表层土壤（距地面5～10cm）中数量最大，深层土壤中数量降低。中性或偏碱性肥沃土壤中数量最多，放线菌的理化特性不同，其在自然界的分布也有差异。革兰染色呈阳性。

放线菌是抗生素的主要生产菌。目前临床应用的链霉素、阿米卡星等十几种抗生素都是由放线菌产生的，还用于制造维生素、酶制剂及污水处理等。放线菌在自然界的物质转化中起着重要作用。

放线菌菌丝体依形态与功能不同可分为三种类型（图2-12）。

（1）基内菌丝　匍匐生长于培养基表面或深入培养基内的菌丝具有吸收营养物质和排泄代谢废物功能，又称营养菌丝。它无隔膜，有的无色，有的可产生色素，可呈不同颜色，所产生的色素可是脂溶性的也可是水溶性的，如是水溶性的可在培养基内扩散。

（2）气生菌丝　当基内菌丝发育到一定阶段向空间长出的菌丝称为气生菌丝，较基内菌丝粗，一般颜色较深，可铺盖整个菌落表面，呈绒毛状、粉粒或颗粒状。

（3）孢子丝　气生菌丝发育到一定阶段分化出可形成孢子的菌丝称为孢子丝（图2-13）。孢子丝有直立、弯曲、丛生和轮生。形态直线状、环状或螺旋状等。在孢子丝上长出孢子，孢子的形状为球形、卵圆形、椭圆形、杆状、瓜子状等。孢子表面有的光滑，有的带小疣、带刺或毛发状的。孢子也常具有色素。孢子丝的着生情况、形态以及孢子的形状、颜色等特征是放线菌分类鉴定的重要依据。

放线菌的主要代表有链霉菌属、诺卡菌属、小单孢菌属等，其中链霉菌属是最大属，据统计，现在临床使用的抗生素有80%是由放线菌产生的，其中90%是由链霉菌属的菌产生的，如链霉素、土霉素、四环素、金霉素、红霉素、万古霉素、新霉素等。

4．病毒

病毒是一类超显微、结构极其简单、专性活细胞寄生和增殖的非细胞型微生物。病毒主要由核酸和蛋白质组成，核酸位于病毒中心，构成了核心；蛋白质包围在周围，构成了衣壳，核心和衣壳合称核衣壳，构成了病毒的基本结构。最简单的病毒是裸露的核衣壳体，较复杂的病毒还具有包膜、刺突等辅助结构（图2-14）。

病毒具有5种基本形态（图2-15）。

（1）球状或多面体　人、真菌、动物病毒多为球状，如腺病毒、脊髓灰质炎病毒等。

（2）杆状或丝状　许多植物病毒多呈杆状，如烟草花叶病毒等。

（3）砖形　如痘病毒、天花病毒等。

（4）子弹状　如植物弹状病毒、水泡性口膜炎病毒、狂犬病毒等。

（5）蝌蚪形　如细菌病毒（噬菌体）。

当病毒大量聚集并使宿主细胞发生病变时，有时可形成肉眼可见的形态，如噬菌斑、枯斑、空斑等。

（三）微生物群体的形态特征

区分和识别各大类微生物，通常不外乎包括细胞形态（个体形态）和菌落形态（群体形态）等两方面的观察。细胞的形态构造是群体形态的基础，群体形态则是无数细胞形态的集中反映，故每一大类微生物都有一定的菌落特征，即它们在形态、大小、色泽、透明度、致密度和边缘等特征上都有所差异，一般根据这些差异就能识别大部分菌落。

1．微生物的菌落

如果菌落是由一个单细胞发展而来的，则它就是一个纯种细胞群或克隆（clone）。如果将某一纯种的大量细胞密集地接种到固体培养基表面，结果长成的各“菌落”相互连接成一片，这就是菌苔。

描述菌落特征时须选择稀疏、孤立的菌落，各种细菌在一定的培养条件下形成的菌落具有一定的特征（图2-16），包括菌落的大小、形状、光泽、颜色、硬度、透明度等等。菌落的特征对菌种识别、鉴定有一定意义（表2-6）。

一般细菌形成较小的圆形菌落，颜色有白色、黄色等，表面光滑或不光滑。产荚膜的细菌在琼脂培养基上形成的菌落，表面湿润，有光泽，黏液状，称为光滑型（S型）菌落。不产荚膜的细菌所形成的菌落，表面较干燥、粗糙，称为粗糙型（R型）菌落。无鞭毛的细菌，常形成较小较厚、边缘较整齐的菌落；有鞭毛的细菌则形成大而扁平、边缘呈波状或锯齿状的菌落。

大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、黏稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。

放线菌菌落由菌丝体和孢子形成，其菌落特征可作为放线菌鉴别的依据。放线菌的基内菌丝体伸入培养基内，与培养基结合紧密，不易被接种针挑起。气生菌丝又紧贴在培养基的表面相互交织成网状，所以菌落表面坚实多皱、致密牢固。当孢子丝成熟形成大量孢子后，就成为带有各种颜色的粉末状或颗粒状菌落。水溶性色素扩散到培养基中，脂溶性色素局限在菌落表面上。放线菌的正面为气生菌丝和孢子丝的颜色，背面为营养菌丝或可溶性色素渗透到培养基内的颜色，不同菌种的颜色各不相同。

根霉与毛霉在固体培养基上生长快，菌丝迅速蔓延，可覆盖整个培养基表面，铺满整个容器，不形成固定菌落。曲霉形成圆形毛毡状菌落，菌落表面平展或有放射状沟纹，菌落生长较快，10～14天直径可达3～7cm，菌落随孢子颜色的不同而呈多样化。青霉的菌落一般呈蓝绿色，菌落表面有明显的放射状沟纹。长时间培养菌落呈现灰色至紫褐色，因能分泌黄色色素，故培养基背面呈黄色。

2．微生物的生长曲线

微生物在适宜的条件下，不断地吸收营养物质并按照自己的代谢方式进行代谢活动，如同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断增加，体积得以加大，于是表现为生长。所谓生长就是指生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加；繁殖是指生物个体数目的增加。但是在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，因此，通常情况下是以群体生长作为衡量微生物生长的指标。群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程。

微生物的生长是以群体为单位进行研究的，微生物在生长过程中受各种因素的影响，不可能无限制地增殖。以微生物的数量（活细菌个数或细菌重量）为纵坐标，培养时间为横坐标，可以绘制出一条描述细菌生长过程规律性的曲线——生长曲线。微生物的群体生长的四个时期包括迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期（图2-17、表2-7）。