实训7 显微摄影技术

【实训目标】熟练掌握显微摄影的基本技能，独立完成显微摄影全过程；初步掌握对照片质量分析的标准。

【实训准备】

1．实训器具 显微镜、显微摄影装置、各色滤光镜、黑白或彩色负性胶片、显影罐、温度计、水浴锅或冰块、暗房袋、暗盒、剪子、胶带（橡皮膏）瓷或塑料盘、盆、量筒、烧杯、放大纸、竹夹、上光机。

2．实训材料 人参、牛膝组织永久制片；大黄、山药粉末制片等。

3．实训试剂 稀甘油、甘油醋酸试液、水合氯醛试液、显影液、定影液、停影液等。

【实训内容及步骤】

（一）显微摄影基本技术训练

1．安装显微摄影装置 将相机、显微镜和照明设备连在一起，并能在观察镜中看到所要拍摄的标本。安装时，需先细读说明书，熟悉仪器结构和功能，连接部位要稳固。

2．调整好显微镜

（1）聚光器和光源灯的调中：显微摄影通常采用中心亮视野透射照明法，摄影前，要把聚光器和光源灯调中，使聚光器中心与视场光阑的中心处于同一光轴上。光源灯的灯丝照明于视野中心。

聚光器的调中步骤：①转动聚光器升降旋钮使聚光器升至顶点位置。②接通光源灯的电源开关。③将被摄的制片标本，放在载物台上，用4 ×或10 ×低倍镜聚焦在样品上。④缩小镜座上的视场光阑，在视野中可见边缘模糊的视场光阑图像。⑤微降聚光器，至视场光阑的图像清晰聚焦止。⑥用聚光器两个调节螺杆推动聚光器，使缩小的视场光阑图像调至视野中心。⑦开放视场光阑，使多角形的周边与视野边缘完全重合。⑧反复缩放视场光阑数次，确认光阑中心和边缘与视野完全重合。⑨使聚光器回复顶点位置。

光源灯调中步骤：在视场光阑上面的滤色镜座上，放一毛玻璃，用以观察灯丝位置，转动光源灯位置，使灯丝位于视场光阑中心，然后固定光源灯。

（2）正确使用光阑：显微镜有两种可变光阑——孔径光阑和视野光阑。正确的调整和使用光阑是保证摄影质量的重要环节。

1）孔径光阑的调节：孔径光阑与聚光镜是构成聚光器的两个重要部分。显微镜的性能主要决定于物镜的性能，而物镜的性能又决定于数值孔径。物镜的数值孔径与聚光镜的数值孔径相关，两者孔径相等时，物镜分辨力最高。聚光镜的数值孔径受孔径光阑控制，用孔径光阑的开放与收缩，调节聚光镜数值孔径的大小。显微摄影不同于一般摄影，其最大的区别是影像反差小，焦点深度浅。这两点可随孔径光阑缩小而提高。孔径光阑小于物镜的数值孔径时，物象的分辨力和亮度降低，但影像反差和焦点深度提高，使影像更加清晰。所以，在不过多地降低分辨力的前提下，把孔径光阑调到所用物镜数值孔径的60%～70%大小是比较合适的。例如，物镜的数值孔径为1.0，孔径光阑的数值调到0.6～0.7，所以，显微摄影时，缩小孔径光阑，尽管丧失少许的分辨力，却提高了影像反差、焦点深度和影像的清晰度。当聚光器标有孔径的数字时，对准所需的值即妥，如果不具孔径光阑数值，在显微镜向标本聚焦后，从镜筒中取下目镜，在物镜的后透镜中可见孔径光阑影像。光阑缩小时，仅见一亮点，逐渐开大光阑，亮孔扩大，直至需要的程度。当光阑缩小，视野亮度降低时，可适当提高电压增加照明强度。

2）视野光阑的调节：视野光阑位于镜座之中，用以控制照明光束的直径，缩小视野光阑，光束直径小于孔径光阑，视野亮度不足，影像不清晰；视野光阑开大，光束直径超出孔径光阑，因光线过多，造成光线的乱反射，影响影像的清晰度。视野光阑的适宜大小，以光阑的边缘外切孔径或孔径光阑内接视野光阑为度。

孔径光阑的调节，取决于所用物镜数值孔径。当两者相等，分辨力最高；孔径光阑小于物镜的数值孔径，影像反差和焦点深度增大。视野光阑随孔径光阑而变，总是外切孔径光阑。更换物镜，数值孔径改变，孔径光阑重新调整，视野光阑亦随之改变。

3．底片选择

（1）底片种类：摄影用的底片有硬片（透明玻璃上涂以感光乳剂而成）和软片（胶片与胶卷）。胶卷常用的规格有135和120。

（2）底片性能

1）底片类型：①彩色底片：反转片和负片，又可分别分为日光型、灯光型和日光灯光两用型。②黑白底片：色盲片、分色片、全色片三种。色盲片为只感受蓝紫和紫外光的底片，适用于黑白、蓝紫色色光影像的摄影，而不能用来拍摄红、绿、黄等色的影像；分色片为能感受蓝紫、黄绿光的底片，除红橙色标本外，可广泛用于显微摄影；全色片：为能感受光谱中全部可见光的底片，对景物明暗层次能较好表现，黑白层次多，反差小。

2）底片感光度：底片对光的敏感程度。感光度单位：①定（DIN）制：每相差三定，感光速度就相差一倍，如21定为18定的二倍，依次类推；②标准制（ASA）：它规定数值增一倍，感光速度也增加一倍，如ASA 100为ASA 50的二倍。21定相当于ASA 100。显微摄影力求使用感光度低的胶片。

（3）底片的选择和应用：①大型显微摄影机选用硬片，小型显微摄影机选用软片。②小型机相所拍底片需要放大，所以选用银粒细的底片。③显微摄影要求反差大就选中速（17～19）定和慢速（14～16）定，甚至特慢速（9～13）定底片，一般以18定（ASA 50）以下为宜。④色盲片和分色片很适合于显微摄影，特别是显微摄影以分色片最好，全色片也可用于显微摄影，但往往要用适当颜色的滤光片，以增加反差，才能达到良好效果。⑤选用灯光型或日光灯两用型彩色底片拍摄具有色彩的样本。

4．曝光的确定 曝光是显微摄影的一个关键。曝光过度，使底片密度很大，昏暗不清，丧失影纹细节，反差太小。曝光不足，整个底片密度很小，比较透明，虽然最大密度部分影纹分明，但最小密度和灰雾密度一样，没有影纹存在，缺乏正常反差。这类底片，根本不能印放出合格的照片。曝光最重要的问题就是判定曝光时间，确定快门速度。显微摄影的视野，亮度变化极大，曝光时间的变化范围宽广，正确估计曝光时间比普通野外摄影要困难得多。常用的估计影像亮度来确定曝光时间的方法，往往因人眼对光强度的显著变化不会有科学的定量分析而致使发生错误。

（1）影响曝光的因素：①照明光源：电压高，功率大的灯泡，光强度高，色温高，使胶片感光快，曝光时间要短。②胶片的感光度：感光度高的胶片对光敏感，曝光时间可短一些；胶片超过有效期，或保存条件不佳，胶片的感光度会降低，使用时要酌情增加曝光时间。③物镜的数值孔径和目镜的放大倍数：物镜的数值孔径大，进光量多，影像亮度大，曝光时间要短；目镜放大倍数大，视野相对加大，影像的亮度相应减小，曝光时间要长。④滤光片的颜色：滤光片减弱了光源的照明强度。在摄影时必须给予补偿，以达到正确的曝光。⑤标本的差异：标本的厚度与颜色的变化影响到光的透过和吸收。另外，在同一标本中，各部分的光量程度也不同，因而也影响曝光时间。

（2）确定曝光时间的方法：①经验法：除经验非常丰富的人外，一般不宜采用。②试摄法：这是一种简单、易行、准确、可靠的确定曝光时间的方法。方法是用同一标本在相同条件下，按几何级数增加曝光时间拍得不同曝光时间的试摄底片，经显影和定影后，根据底片情况决定正确的曝光时间。③测光表法：显微摄影中可使用的测光表有四种类型：手持光电测光法；显微摄影用的光电测光表；显微摄影装置内装或外接式全自动曝光控制表；装在普通相机内部的测光表。前两种可以通用，但不够精确，后两种方便而准确。（表1-1）

5．取景对焦和拍摄

（1）屈光度的调节：在侧视目镜取景器内有一玻璃屏，上刻双十字线。调节时，左右转动屈光度调节环，使侧视目镜取景器镜筒的前端伸缩，改变焦距，至清晰地分辨出双十字线止（图1-6）。双十字线校准后，不能随意变动屈光度调节环，以防焦距改变。取景聚焦，只需使用显微镜调焦螺旋。

（2）取景：在显微摄影中要根据研究目的进行取景，取景的含义是确定拍摄范围和物体影像在底片上的大小（倍数）。专用显微摄影设备，在刻有双十字线的侧视目镜取景器的玻璃屏上刻有数种规格的长方形取景框。底片所能摄下的范围，并非视野所见的全部，仅是圆形视野中长方形部分（图1-7）。

取景时，要使被摄的物体影像中心位于长方形取景框的对角线中心，并使两者的长短相应。需要90°调整时，转动载物台或摄影装置，让影像的长轴和取景框横轴平行。影像的大小可采用调换物镜和目镜来控制。

（3）聚焦与拍摄：转动显微镜的粗细调焦螺旋，改变物镜和被检物体的距离，使视野中物体影像的焦点聚于暗箱的焦平面上。

纵横移动镜台的制片标本，寻找拍摄的图像；上下转动调焦螺旋，辨清标本的细微结构。取景聚焦，需几经反复。底片影像的清晰度决定于拍摄前的最终一次准焦。

取景聚焦完毕，立即揿下快门按钮，任何有关操作，都要在聚焦前完成。准焦后的微小颤动，也会引起焦点的改变，致使拍出的底片影像模糊不清。

6．记录 由于显微摄影是记录科学研究结果的一种方法，因此在显微摄影中，每拍一张或每拍一批都要详细记录已拍底片的拍摄条件和情况，如被摄标本特点、仪器组合、照片条件、曝光时间、底片型号等，以作今后工作参考。

（二）徕卡DMLB型显微镜带MPS 30/60型显微镜摄影控制器操作程序

1．清洁 对显微镜机械、电路、光学元件、相机以及自动曝光控制装置清洁。不仅要严格要求仪器的洁净，而且对桌、椅、地板也保持干净，室内尽量少灰尘。

2．接电源 将LEICA DMLB型显微镜和LEICA MPS 30/60型自动曝光控制器接上稳压器的输出电源接线板插座210～215V上。

3．打开开关 显微镜底座左边露出半圆黑色转板，将其向外转到1～2V的点上，再打开镜座左边前沿的红色开关，镜座上透射出的微弱的光亮，待灯丝预热1～2分钟后再调用。

4．调双目镜同焦 先对左边目镜，旋动粗调焦螺旋，使载物台的载玻片靠近10 ×物镜，再用左眼看左边目镜，边看边下调载物台，当看到标本组织的清晰像后，再微调到最清晰为止。然后调右边目镜，这时就不去调粗、细调焦螺旋，仅调右目镜上的上下移动螺纹，使右目镜焦距调到视野中标本组织像最清晰为止。这时，左、右两目镜即能适应您的双眼的同焦。

5．调瞳距 将双目镜筒用双手拿住，边往里外伸缩，边用双眼观察视野标本，使两个视野合并到一个圆视野为止。

6．调视场光阑 收缩视场光阑，将聚光镜向上升到顶后，接近载物台往下降，直至看到多边形的视场光阑像为止，转动调中螺丝将视场光阑调正中，然后将视场光阑像多边形边缘放大到视野圆的外切。

7．调孔径光阑 取下目镜，放入辅助望远镜，旋动辅助望远镜，以看清孔径光阑像为止。调节对中螺丝，使孔径光阑处在正中。再开大孔径光阑到60%～80%。也可按刻度标记计算，如利用物镜10 ×，其数值孔径（NA）为0.25，即0.25×80% =0.2，即将孔径光阑调在刻度的0.2上。如是物镜40 ×, NA为0.65，即0.65×80% =0.52，即调在刻度0.52上。

8．放入照相目镜 选用配置好的照相目镜（目镜上有“PHOTO”）倍数为10 ×。

9．选用物镜 可选用平消色差物镜（N PLAN, PLAN）、荧石物镜（半平场复消色差PL FLUOTAR）物镜或平场复消色差物镜（PLAPO），但以后者为最好。

10．调双直线 用调标本焦点照相的那只眼睛，边观察取景筒，边调节取景筒上螺旋，直至“+”字双线的双线间分开得非常清晰为止。

11．取景 以“24×36”的方框内选取组织部位作为拍摄范围。

12．装入底片 打开摄影装置上相机后背，按顺序插入胶卷，左手按着片头送入收片轴，使胶片卷入收片轴，稳妥后，关上后盖，等待2～3秒后，即听到马达转动齿轮声，它将胶卷片头送入收片轴绕转柱，约拉过胶卷上24个齿孔（三张画面长度），相机正面上的画幅记数窗口即呈现出“01”数字。

13．放滤光镜 用黑白全色片拍一般H. E染色组织片用绿色滤光镜（灯泡电压一般用6～9V）；日光型彩色片用DLF滤光镜（灯泡电压要调在10.5V以上）；灯光型彩色片不用滤光片，而只将灯泡电压调在10.5V以上。

14．核对 在曝光前要核对“+”字双直线，取景范围，对标本焦点，电压数，ASA（胶卷感光度）， CAL（曝光指数）， AUTO（自动曝光模式）， FIX（手控曝光模式），检查无误后再拍摄。LEICA MPS 30/60型自动曝光控制器开机后的默认方式是自身识别胶卷的感光度，CAL为1.00，曝光模式为AUTO。

15．曝光 按LEICA MPS 30/60型自动曝光控制器的“EXPO”键，边按键，边观察相机的供片轴是否响动，画幅数字窗口是否显示出递增数字，如有响动和显示递增数字则表示自动曝光控制器运转正常，以后，继续拍摄2～36张，即按第12～16步常规进行。如没有响动或不递增数字，即出故障。每拍摄一张应记录好标本名称、拍摄内容和放大倍数等。

16．倒片 胶卷拍完后，相机会自动倒片，直至全卷倒完（如一卷只拍了十几张不拍，需要将拍过胶卷部分取出来，这时要按相机正面上的倒片黑按钮进行倒片，记录当时拍的张数，以供下次接着拍剩余胶卷），当转到有片头响声后，才能打开相机后盖，取出胶卷。摄完的胶卷要用黑纸或底片盒装好，待冲洗。底片盒上要注明拍摄内容、拍完日期。

（三）YS100 NIKON数码摄影显微镜操作程序

YS100 NIKON摄影显微镜在国内较为多见，价格低廉，操作简便，配备数码相机，使用广泛。

1．准备工作 ①将NIKON数码相机装入相机电池、存储卡，将相机安装在YS100显微镜上，取下相机镜盖，打开数码相机的ON-OFF电源开关，数码相机的安全灯点亮；②将需要显微摄影的染色体图像置于取景中心；③将光路选择器拉杆，向外拉出一级，露出拉杆上的绿色环带。

2．选择拍摄模式COOLPIX 4500数码相机有全自动的AUTO模式，16种场景选择模式，控制曝光方式的程序自动P模式，控制快门后的最佳曝光S模式，控制光圈后的最佳曝光A模式，手动M模式。按住MODE按钮，并旋转指令拨盘，拍摄模式会循环显示这6种模式（AUTO-自动模式，场景模式，M-手动模式，A-光圈优先自动模式，S-快门优先自动模式，P-程序自动模式）。相机默认值是全自动AUTO模式，即一种一按机拍模式。为使曝光准确、快捷，多采用自动曝光模式，但在某些条件下，应用手控曝光M模式更为适宜时。

3．选择曝光模式 选择自动曝光AUTO模式后，闪光灯及调焦全是自动，影像像素一般，可以单帧连拍。在AUTO模式下，按下菜单按钮，会出现一个调节影像品质和尺寸大小的菜单。通过影像品质，可以选择高精、精细、一般及基本四个档次的影像品质；通过尺寸大小可以选择2272×1704、1600×1200、1280×960、1024×768，这些尺寸大小在16BM储存卡上精细影像品质条件下分别为8张、16张、24张、27张，在一般影像品质条件下分别为16张、31张、47张、69张，在基本影像品质条件下分别为32张、59张、86张、121张。选择P、S、A和M拍摄模式，在P、S、A和M拍摄模式下，菜单选项旁出现一个圆盘状图标，通过指令拨盘，可以从主菜单中直接选用“最佳拍摄选择”（BSS）

4．选择影像品质和尺寸大小 通过影像品质，可以选择高精、精细、一般及基本四个档次的影像品质；通过尺寸大小可以选择2272×1704、1600×1200、1280×960、1024×768的尺寸大小，拍摄照片数同上。

5．取景 ①取景：可以在显示屏（A）或取景器（B）中进行取景。②光源补偿：自动曝光AUTO模式下光源不足时，内置闪光灯会自动弹起补光，拍摄时注意不要压住内置闪光灯，会自动弹片；P、S、A和M拍摄模式下光源补偿，应在P、S、A和拍摄模式下拉菜单选项中，通过指令拨盘，从主菜单中直接选用闪光灯打开，在光源不足时内置闪光灯会自动弹起补光。③选择拍摄主体：使用变焦按钮将需要拍摄的物体移入取景框内，按一下ZOOM变焦按钮，可以在显示屏或取景器上进行光学变焦，按下W键，可以使图像推远，按下T键，可以使图像拉近；在最大光学变焦位置时，按住T按钮2秒，会进行数码变焦，使图像拉近并放大，光学变焦图像细微部分也会同时放大，且在显示屏或取景器上均能看到，但数码变焦图像细微部分不会放大，仅在显示屏上能够看到。

6．对焦与拍摄 ①对焦：通过目镜取景器寻找理想的拍摄物像时应对被摄样品对焦。半按快门，能对拍摄物像进行对焦。AUTO模式下相机对焦在对焦区域中央物体，取景器中会显示对焦目标。持续半按快门，可以持续保持锁焦的状态。如果光线不足，在闪光灯设定为自动时，闪光灯会自动弹起开始充电。②拍摄：图像清晰之后，将半按的快门全按到底，即进行拍摄。反复取景、对焦、拍摄，将选择确定的拍摄物像拍摄完毕。

7．整理好相机 ①关闭相机电源。②内置光源灯弹起时，应垂直用力收回内置闪光灯，注意不要从侧面、背面或正面施加压力，以免损坏闪光灯。③将镜头收回原位。④盖上镜盖。

8．图像输入计算机 ①连接相机与计算机，在连接之前应该将Nikon View5.0软件安装在计算机。②开启相机电源。③传输影像到计算机内。④观察图像效果。

（四）底片冲洗技术

1．显影罐法 ①显影：采用化学的方法（已感光的乳剂与显影液起化学反应）使底片上的潜影成为可见影像（不稳定）的过程。显影前最好先向罐中倒入20℃左右的清水，浸洗1～2分钟，使底片的全部药膜均匀浸湿后，倒出清水。②停影：停显液作用：一是制止显影后底片乳剂膜中残存的显影液继续发生作用，防止底片显影过度产生斑痕或灰雾等现象；二是防止显影液内碱性物质带入定影液，并与定影液中的酸性物或矾类作用产生亚硫酸铝的白色沉淀。常用停显液为1.34%醋酸水溶液，摇动几下，约半分钟倒出停显液。③定影：用定影剂溶解感光乳剂中未感光的卤化银，使不稳定影像变为稳定影像的过程。加入等量定影液，约15～20分钟后，倒出定影液。④清洗：定影后的底片上还残留许多硫代硫酸钠或银的络合物。必须经充分水洗，以避免底片发黄或变色。中速流水冲洗时，胶卷不少于20分钟；用于制作单色幻灯片的电影正片水洗干净后即可转入染色处理至少要30分钟以上。⑤晾干：科研底片或暂时不染色的幻灯片底片，水洗后可用片夹夹住胶卷两端，其中一端悬起，拭干底片水珠，用夹子夹住，置通风阴凉而无尘处晾干。

2．盆中显影法 取三只搪瓷盘或塑料盘，排成一排，依次加入20℃显影液、停影液和定影液。要注意设法使温度保持20℃左右，如有空调设备最理想。要求暗室内全暗，除彩色片外，也可在暗红或深暗绿色的安全灯下操作。取出底片使药膜面向上，迅速而均匀地浸入显影液中，然后不断使盆中药液移动，显影时间根据底片情况而定。显影结束后，洗相夹住底片边缘，投入停显液中约半分钟，再取出放入定影液中约15～20分钟后，这时可开灯，检查底片上乳白色是否完全消除，再放15分钟，就可取出在流水中冲洗半小时以上。最后用夹子夹住底片晾干。

（五）放大技术

照片放大是利用透过底片的光线，通过放大镜头的集光作用，把底片的影像放射到放大机外面。这时放大机中心垂直的某一平面上，即形成与底片相同且倍数较大影像。若这个平面是放大纸，经感光、显影、定影等处理，即可形成与底片相反、与实物相同的照片。

1．放大纸的选择 ①放大操作首先要准确鉴别底片密度的反差能选配适当的放大纸和印相纸。然后根据需要放大尺寸调整机身的位置。②放大时纸的选配也相当重要。目前国产放大纸分为4号：1号（性能软）；2号（较软或中性）；3号（较硬）；4号（硬）。一般是底片反差偏小时，选用偏硬的放大纸，就可得到适中的照片，如底片反差偏大时，则选用偏软的放大纸，也可得到反差适中的照片。常用3号放大纸。③选好放大纸后剪小块纸作几次不同曝光时间和纸型的试放，从而确定正式的放大纸型和曝光时间。放大时，纸要稍大于放大尺寸。曝光计时最好用定时器。

2．使用放大机的注意事项 ①底片和感光纸的平面必须同镜头相平行，底片的中心必须对着镜头的光轴。②底片要摆在放大机中央部位，并用黑纸将底片四周透光部位遮挡起来。③调焦时要开大镜头光圈，所用的成像白纸厚度应与所用的放大纸厚度相等。对清楚焦点后将光圈收缩，使画面中央和四周都能达到一定清晰度。④在放大曝光的过程中不得使放大机受震动。⑤大批量放大照片，电源上要装有稳压器，并使用电子自动曝光器曝光。⑥放大机内部，镜头与聚光镜必须保持清洁，不得有灰尘。

3．放大照片的显影 冲洗用搪瓷盆或塑料盆进行，并列放好三只盆，依次倒入20℃左右的显、停、定影液。①显影：取曝光后的放大纸，将药膜面向下，浸入显影液中，用夹子按动照片背面，使乳剂膜完全浸入显影液中，并不断拖动放大纸。②停显：待所有细微部分都均匀地显现出来后用洗相夹取出放大纸，移入停显液中，漂洗10～20秒。③定影：再移入定影液中约15分钟。④漂洗：然后放在水中充分漂洗约1小时。⑤上光：最后从水中取出放大纸，平放在上光板上，影像面朝上光板，放在上光机电热器上烘干，照片自动胶落。⑥存放：再用切刀把照片边缘裁齐，登记编号，装袋或装册保存备用。

4．照片放大倍数的确定 照片上物象的放大倍数可用两种方法确定：

（1）照片上物象的放大倍数=显微摄影放大倍数×放大机的放大倍数

（2）在显微摄影时，把测微尺放在载物台上，用拍摄样品同样的倍数拍摄标尺，然后像样品底片那样在放大机上同样放大，洗出照片，用照片的标尺可直接读取所摄样品的大小。

【实训报告与考核】拍摄人参根、大黄粉末显微照片，并计算出其放大倍数。在显微摄影中要得到一张好的照片必须注意哪些问题？