第二节　黄酮类成分的分析

一、理化性质

1.性状

黄酮类化合物多为结晶性固体，少数为无定形粉末（如黄酮苷类）。一般游离状态的黄酮较黄酮苷易形成结晶。黄酮类化合物多呈黄色，一般情况下，黄酮、黄酮醇及其苷类多呈灰黄～黄色，查耳酮为黄色～橙黄色，二氢黄酮、二氢黄酮醇及黄烷醇因无交叉共轭体系，几乎为无色，异黄酮类不显色或显微黄色。花色素及其苷元的颜色随pH值不同而改变，一般显红色（pH<7.0），显紫色（pH=8.5），显蓝色（pH>8.5）。

2.旋光性

多数游离的黄酮苷元无旋光性，二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷醇、二氢异黄酮等因分子中含手性原子而具有旋光性。黄酮苷类由于结构中含有糖部分，故均有旋光性，且多为左旋。

3.溶解性

一般游离苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱水溶液。其中黄酮、黄酮醇、查耳酮等平面性强的分子，因分子间排列紧密，分子间引力较大，故更难溶于水；二氢黄酮及二氢黄酮醇等，因系非平面性分子，分子间排列相对不紧密，分子间引力较低，有利于水分子进入，故溶解度稍大。

至于花色素苷元类虽也为平面性结构，但因以离子形式存在，具有盐的通性，故亲水性较强，在水中溶解度较大。

游离苷元中引入羟基，将增加其在水中的溶解度；而羟基经甲基化后脂溶性增加，在有机溶剂中的溶解度增加。

黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，可溶于乙酸乙酯，难溶或不溶于苯、乙醚、三氯甲烷等有机溶剂中。苷分子中糖基的数目和结合的位置对溶解度亦有一定影响，一般多糖苷的水溶性大于单糖苷。

4.酸碱性

（1）酸性　黄酮类化合物因分子中具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶中。其酸性强弱与酚羟基数目及位置不同有关，以黄酮为例，其酚羟基酸性强弱顺序依次为：

7，4'-二羟基>7-羟基或4'-羟基>一般酚羟基>5-羟基

由于7、4'位上羟基处于羰基的对位，在p-π共轭效应的影响下，酸性较强，可溶于碳酸钠水溶液中，酸性强的黄酮类化合物甚至可溶于碳酸氢钠水溶液中。而一般酚羟基处于羰基的间位，不能通过共轭效应产生影响，酸性较弱；5位上酚羟基处于羰基的邻位，可与羰基形成分子内氢键，酸性最弱，酸性弱的黄酮类化合物可溶于氢氧化钠水溶液中。此性质可用于提取、分离及鉴定工作。

（2）碱性　γ-吡喃环上的1位氧原子，因有未共用电子对，故表现出微弱的碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成盐，但生成的盐极不稳定，遇水后即可分解。

二、定性分析

1.化学分析法

黄酮类化合物的颜色反应主要是利用分子中的酚羟基及广吡喃酮环的性质。

（1）还原反应

①盐酸-镁粉反应：多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物显橙红色～紫红色，少数显紫色或蓝色，特别是分子中当B环上有—OH或—OCH3取代时，呈现的颜色亦随之加深。但查耳酮、橙酮、儿茶素、异黄酮不显色。

②四氢硼钠还原反应：为二氢黄酮、二氢黄酮醇类化合物专属性较高的一种还原反应。在样品的甲醇或乙醇液中，加入等量的2％Na BH4的甲醇溶液，1min后，加浓盐酸或浓硫酸数滴，二氢黄酮、二氢黄酮醇类化合物与之反应显红色～紫红色，其他黄酮类不显阳性，可进行区别。

（2）与金属盐类试剂的络合反应　黄酮类化合物分子中若具有3-羟基、4-羰基，或5-羟基、4-羰基或邻二酚羟基，则可以与一些金属盐类试剂如铝盐、锆盐、铅盐、镁盐、锶盐等反应，生成有色的络合物、有色沉淀或使产物的颜色加深，有的还产生荧光。这些性质可以作为黄酮类化合物的定性、定量及结构测定的依据。

①三氯化铝反应：加1％三氯化铝（或硝酸铝）甲醇液，生成铝络合物显黄色，置紫外光灯下显黄绿色荧光，可用于定性及定量分析。

②锆盐-枸橼酸反应：此反应常用于区别3-羟基黄酮和5-羟基黄酮。在样品的甲醇溶液中加入2％二氯氧锆（Zr OCl2）的甲醇溶液时，3-羟基黄酮、5-羟基黄酮类化合物均能与之生成络合物而显鲜黄色，当再加入2％的枸橼酸甲醇溶液时，3-羟基黄酮仍为鲜黄色不退；5-羟基黄酮鲜黄色显著减退。这是因为C5位羟基、C4位羰基与锆盐生成的络合物没有C3位羟基、C4位羰基与锆盐生成的络合物稳定，借此可区别两者。

③氨性氯化锶反应：黄酮类化合物的分子中若含有邻二酚羟基，则可与氨性氯化锶试剂反应，产生绿色～棕色乃至黑色沉淀。该性质可用于检测分子中是否含有邻二酚羟基。

④醋酸镁反应：该反应可区别二氢黄酮（醇）类化合物与其他类黄酮。在滤纸上滴加样品乙醇溶液，喷以1％醋酸镁的甲醇液，加热干燥，在紫外光灯下观察。二氢黄酮、二氢黄酮醇类化合物可显天蓝色荧光，而黄酮、黄酮醇及异黄酮类化合物等则显黄色、橙黄色或褐色。

⑤铅盐反应：常用1％醋酸铅及碱式醋酸铅水溶液，可生成黄色～红色沉淀。醋酸铅只能与分子中具有邻二酚羟基或兼有3-羟基、4-酮基或5-羟基、4-酮基结构的化合物反应生成沉淀。而碱式醋酸铅的沉淀能力要大得多，一般酚类化合物均可与其发生沉淀。

2.色谱分析法

（1）薄层色谱法　薄层色谱法也是黄酮类成分定性分析常用的方法。一般采用吸附薄层色谱，常用的吸附剂有硅胶、聚酰胺等。

①硅胶薄层色谱：主要用于检视和分离极性较小的黄酮苷元，也可用于检视和分离黄酮苷类化合物。检视和分离黄酮苷元时常用极性较小的溶剂系统展开，如甲苯-甲酸甲酯-甲酸（5:4:1），也可以根据成分的极性大小适当调整甲苯与甲酸的比例；检视和分离黄酮苷类则采用极性较大的溶剂展开，如正丁醇-乙酸-水（3:1:1）等。

②聚酰胺薄层色谱：适宜检视和分离各类型含有酚羟基的黄酮苷元与苷。由于聚酰胺对黄酮类化合物吸附能力较强，因此，需要用较强极性的展开剂，展开剂中大多含有醇、酸或水。检视和分离黄酮苷常用含水的有机溶剂为展开剂，如甲醇-乙酸-水（90:5:5）等；检视和分离黄酮苷元常用有机溶剂为展开剂，如三氯甲烷-甲醇（94:6）等。

黄酮类成分经薄层色谱分离后，紫外光灯下可观察到荧光，黄酮醇类常显亮黄色或黄绿色，异黄酮类多呈现紫色。喷三氯化铝试剂后，日光下黄酮醇类无色，查耳酮类显黄色或橙黄色。但在紫外光灯下，荧光均加强，黄酮醇类为黄色或绿色荧光，异黄酮类显黄色荧光，查耳酮显橙色荧光。经薄层色谱分离后，用显色剂显色，于紫外光灯下观测是黄酮类成分定性分析常用的方法，也是鉴定各种类型黄酮的方法。

（2）纸色谱法　纸色谱可用于检视各种类型黄酮类成分。可采用单向纸色谱或双向纸色谱，溶剂系统可选择中性与酸性溶剂系统。由于游离的黄酮苷元难溶于水，而黄酮苷为水溶性的，在水中溶解度较大，如果仅选用水为展开剂，则黄酮苷移动快，Rf值大，而黄酮苷元移动很慢。所以，对于黄酮苷元一般用醇性溶剂或极性稍小的溶剂，黄酮苷类双向纸色谱第一展开剂选用醇性溶剂，第二展开剂选用水。也可用水和有机溶剂按一定比例混合为溶剂系统，根据黄酮苷元和苷的溶解度不同，可以调节展开剂的极性，避免Rf太大或过小的缺点。水饱和的乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂为溶剂系统，对极性大或小的成分都能得到合适的Rf值。

三、定量分析

黄酮类成分的定量分析主要有分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法等方法。

（1）分光光度法　分光光度法一般可用于总黄酮类成分的含量测定。黄酮类成分由于分子结构多含有交叉共轭体系，一般都显一定的颜色，以黄色为主，此外由于黄酮化合物母核苯环上常含有一个或两个相邻的羟基，这些羟基能与一些金属离子，如铝、铁、锶等离子形成络合物，呈现黄色或橙色，从而在光谱上产生明显变化。故可利用黄酮类化合物的这些颜色或荧光上的特征进行分析鉴别和比色测定含量。

（2）薄层扫描法　薄层扫描法是测定中药中单体黄酮类成分的有效方法。中药样品经有机溶剂或水提取后，可用硅胶薄层色谱、聚酰胺薄层色谱分离。再用薄层扫描仪（单波长或双波长）直接在薄层板上测定。

（3）高效液相色谱法　高效液相色谱法具有快速、准确、分离效果好等优点。而黄酮类化合物在紫外光区有较强的吸收，故用高效液相色谱法检测灵敏度高。如含有黄酮类化合物的中药，只要经过适当的预处理，并选择好色谱条件，一般都能得到满意的分析结果。

黄酮类成分的高效液相色谱法条件分为正相与反相色谱两类。正相色谱多用于没有羟基的黄酮类化合物或乙酰化黄酮类化合物，固定相为硅胶，流动相采用用薄层色谱条件，但极性要相对小一点。—CN键合相色谱不仅适用于乙酰化黄酮成分，而且也适用于带有一个羟基的黄酮类成分，流动相为乙烷-三氯甲烷。含有2个以上羟基的可选用—NH2键合相，流动相可选用二烷-二氯甲烷（1:9）。反相色谱测定多用C18键合相固定液，流动相常用甲醇-水-乙酸（或磷酸缓冲液）及乙腈-水。检测仪器主要采用紫外检测器或荧光检测器。