第三章　中药及制剂中各类化学成分分析与检测方法

第一节　生物碱类成分的分析

一、理化性质

1.性状

多数生物碱为结晶形固体，少数为非晶形粉末（如乌头原碱），极少数小分子生物碱为液体（如烟碱、毒芹碱等）。生物碱一般为无色或白色，如结构中具有较长共轭体系，并有助色团，或同时为离子型化合物时可显不同颜色（如小檗碱、木兰花碱为黄色，血根碱的盐为红色）。生物碱多具有苦味、个别也有其他味道（如甜味、辛味等）。少数液态及小分子固体生物碱具挥发性，个别生物碱还具有升华性。

2.旋光性

含有手性碳原子或本身为手性分子的生物碱具有旋光性，多为左旋。一般左旋的生物碱具有较强的生物活性，而右旋体的生物活性则无或极弱。

3.溶解性

生物碱的溶解性与其结构中的氮原子的存在状态、官能团极性大小、数目及溶剂等因素有关。游离生物碱极性较小，难溶或不溶于水，可溶于乙醇、丙酮、乙醚、三氯甲烷等有机溶剂；生物碱的盐极性较大，大多易溶于水和醇，难溶或不溶于乙醚、苯、三氯甲烷等；季铵类生物碱极性较大，易溶于水；小分子生物碱和液体生物碱也易溶于水，如麻黄碱、烟碱等。某些结构中含有羧基、酚羟基等酸性基团的生物碱还能溶于碱性溶液中；若分子中存在内酯环结构，在碱水中内酯环开裂、成盐而溶解，加酸又能析出。

4.沉淀反应

在酸性水溶液中可以与生物碱反应生成不溶于水的复盐或分子络合物的试剂称为生物碱沉淀试剂。生物碱沉淀试剂可用于生物碱类成分的定性鉴别，当某些沉淀试剂与生物碱生成的沉淀组成稳定时，还可用于生物碱类成分的含量测定。常用的生物碱沉淀试剂见表3-1。

5.碱性

生物碱因其分子中氮原子上的孤对电子能接受质子而显碱性，能与酸反应成盐。生物碱的碱性强弱与氮原子的存在状态和杂化方式有关，碱性的p Ka值大小顺序一般是：胍类>季铵碱>脂肪胺>芳杂环（吡啶）>酰胺类。通常情况下，氮原子的杂化度越高碱性越强，即sp3>sp2>sp1。一般碱性强的生物碱在植物体中多与植物中的有机酸结合成盐，以盐的形式存在；而碱性很弱的生物碱，则以游离状态存在。

6.显色反应

许多生物碱能与一些试剂如Mandelin试剂（1％钒酸铵的浓硫酸溶液）、Frohde试剂（1％钼酸钠或5％钼酸铵的浓硫酸溶液）和Macrquis试剂（30％甲醛溶液0.2mL与10mL浓硫酸混合）产生不同颜色，可借以区别生物碱。但由于容易受杂质干扰（如蛋白质等），因此检测结果不太准确。

二、定性分析

1.化学分析法

沉淀反应是生物碱理化鉴别常用的方法。常用的生物碱沉淀剂有碘-碘化钾、碘化铋钾、碘化汞钾、苦味酸、硅钨酸等。多数沉淀反应是在酸性环境中进行，苦味酸等试剂可在中性条件下进行。用沉淀反应鉴别时需注意，中药水浸出液中的蛋白质、多肽和鞣质等成分也可与生物碱沉淀试剂生成沉淀，产生假阳性从而导致鉴别结论错误。因此，由此法进行中药中是否含生物碱类成分分析时，要先用适宜的方法处理样品供试液，以排除杂质类成分的干扰，避免产生假阳性。

2.色谱分析法

色谱分析法是检视中药中生物碱类成分常用的方法之一。包括薄层色谱法（TLC）、纸色谱法（PC）、高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法（GC）。

（1）薄层色谱法（TLC）　吸附剂常用硅胶或氧化铝。供试品溶液的制备要根据被测成分的特点（如存在状态、理化性质及共存成分的性质等），选用适宜的溶剂和方法进行提取、纯化精制。展开剂多为三氯甲烷、苯等弱极性有机溶剂，可根据被测成分的极性加入其他溶剂调整展开剂的极性大小，以达到满意的分离效果。薄层色谱展开后，有色生物碱可直接日光观察，有荧光的生物碱可在紫外光灯下观察，绝大多数情况需进行显色，常用的显色剂是改良碘化铋钾试剂，有时也可用碘化铋钾显色后再喷硝酸钠试剂，可使样品斑点颜色更明显，易于观察。

当使用硅胶作吸附剂时，由于硅胶显弱酸性，强碱性的生物碱在硅胶色谱板上能形成盐，而使Rf值变小或出现拖尾、形成复斑等现象。因此在使用硅胶吸附薄层色谱时，通用碱性展开系统（如加入氨水等）或在碱性环境下（用氨蒸气饱和平衡）进行展开。

（2）纸色谱法（PC）　纸色谱法可用于生物碱盐或游离生物碱的鉴别。当鉴别生物碱盐时，由于生物碱是以解离形式存在，极性较大，一般以滤纸中所含水分作为固定相，用正丁醇-乙酸-水（BAW）系统作为展开剂。当生物碱以游离碱态存在时，常以甲酰胺等作为固定相，以甲酰胺饱和的亲脂性有机溶剂，如苯、三氯甲烷或乙酸乙酯等作为展开剂。生物碱纸色谱的显色剂与薄层色谱法显色剂基本相同。

（3）高效液相色谱法（HPLC）　高效液相色谱法对结构十分相似的生物碱有良好的分离效果，用于生物碱类成分的鉴别时，具有快速、灵敏、微量等优点。在一定的高效液相色谱条件下，各种生物碱都有一定的保留时间，可作为定性鉴别的依据，但多数情况下采用标准品对照定性。

（4）气相色谱法（GC）　具有挥发性且对热稳定的生物碱（如麻黄碱、烟碱等）可用气相色谱法进行鉴别，其定性依据与高效液相色谱法相同。

三、定量分析

生物碱类成分含量测定方法很多，常用的有酸碱滴定法、分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法、气相色谱法及毛细管电泳法。

1.酸碱滴定法

生物碱类成分的碱性使其可用酸碱滴定法进行定量分析。通常根据生物碱的碱性不同，选用水溶液酸碱滴定及非水溶液酸碱滴定两种方法进行含量测定。

游离生物碱多为亲脂性，不溶于水，水溶液酸碱滴定法是先将生物碱溶于过量的标准酸溶液中（如0.01mol/LH2SO4溶液），再用标准碱溶液（如0.02mol/L NaOH溶液）回滴。指示剂可用溴酚蓝、甲基红、溴甲酚蓝等，如《中华人民共和国药典》2005年版中麻黄总生物碱的含量测定即采用此法。其他如颠茄、槟榔、苦参等的总生物碱也可用此法进行测定。

由于大多数生物碱的碱性较弱，常用非水溶液酸碱滴定法。在非水溶液酸碱滴定法过程中多用冰醋酸为溶剂，0.1mol/L高氯酸标准溶液为滴定液，溴酚蓝、酚酞为指示剂。盐酸麻黄碱、盐酸小檗碱、盐酸川芎嗪等都可用非水溶液酸碱滴定法测定含量。

2.分光光度法

根据生物碱分子结构的不同，若生物碱类成分在紫外区有吸收，就可用紫外分光光度法对其进行定量分析。若生物碱类成分在可见区有吸收，或在可见区无吸收，但可通过加入一些试剂能显色的生物碱类成分，均可用可见分光光度法测定，即比色法。

（1）紫外分光光度法　在紫外区有吸收的生物碱类成分，可在其最大吸收波长处测定，利用其吸收度与生物碱的量成正比的原理进行定量分析。如雷公藤总生物碱的测定波长为267nm，通过吸收系数法或对照品对照法进行定量计算。当其他共存成分有干扰时，也可采用分光光度法。

（2）比色法　用比色法测定生物碱类成分常用下列三类方法：①加酸性染料比色法；②与生物碱沉淀试剂产生有色沉淀，定量分离沉淀后，用适当溶剂溶解后比色，如苦味酸钠比色法、雷氏铵盐比色法等；③根据生物碱自身的性质或分子中所含官能团与某些试剂反应生成的颜色进行比色，如异羟肟酸铁比色法。

①加酸性染料比色法：在一定pH介质下，生物碱可与H+结合成生物碱阳离子，而酸性染料在此条件下解离为相应阴离子，二者可定量地结合成有色离子对。此离子对经有机溶剂定量提取，测定有机溶剂提取液的吸收度或再经碱化后定量放出染料的吸收度，即可计算出生物碱的含量。加酸性染料比色法广泛用于中药中生物碱类成分的测定。如川芎、防己、百部、浙贝母和附子等总生物碱的含量测定。

②雷氏盐比色法：雷氏盐NH4［Cr（NH3）2（SCN）4］在酸性介质中可与生物碱类成分定量地生成难溶于水的有色生物碱雷氏盐沉淀B［Cr（NH3）2（SCN）4］。含两个或两个以上氮原子的生物碱，则可与雷氏盐进一步作用生成双盐、三盐等沉淀。应用雷氏盐比色法比色测定时应注意：a.雷氏盐的水溶液在室温下可分解，故需临用临配，沉淀反应在低温条件下进行较好；b.雷氏盐的丙酮或丙酮-水溶液的吸收值随时间变化而有变化，故需快速测定。

③苦味酸钠比色法：在弱酸性溶液或中性溶液中生物碱可与苦味酸定量生成苦味酸钠沉淀，该沉淀可溶于氯仿等有机溶剂，也可以在碱性条件下解离释放出生物碱和苦味酸用来进行含量测定。

④异羟肟酸铁比色法：含有酯键结构的生物碱，在碱性介质中加热酯键水解，产生的羧基与盐酸羟胺反应生成异羟肟酸，再与Fe3+生成紫红色的异羟肟酸铁，在波长530nm处有最大吸收，测其吸收值，即计算生物碱的含量。

3.薄层扫描法

薄层扫描法测定生物碱类成分的含量具有方便、快速的优点，因而应用较广。通常薄层扫描法测定时对供试液纯度要求不是太高，但由于中药中化学成分复杂，待测定成分含量一般较低，因此在层析前需进行纯化处理，以提高其纯度。

采用薄层扫描法进行生物碱类成分含量测定时，所选用的吸附剂、展开剂及显色剂与其定性鉴别相似，但要求要严格。生物碱类成分在薄层扫描时，多采用双波长反射式锯齿扫描，若被测成分本身具有荧光时，也可采用荧光扫描，如盐酸小檗碱等。

4.高效液相色谱法

高效液相色谱法是生物碱类成分定量分析最常用的方法，尤其适用于单体生物碱成分的含量测定。根据生物碱类成分碱性强弱、存在形式不同，可选用吸附色谱法、分配色谱法及离子交换色谱法等，其中分配色谱法应用最多。

在分配色谱法中，反相分配色谱在生物碱类成分的分析方面应用最为广泛。反相高效液相色谱中多采用非极性化学键合固定相，如十八烷基键合相（简称ODS或C18）、辛烷基键合相（简称C8）。最常用的流动相为甲醇-水、乙腈-水等混合溶剂。

正相高效液相色谱常用的固定相有极性化学键合相（如氰基柱）和原型硅胶。在单体生物碱成分分析时，多用原型硅胶为固定相，但其分离原理属于液-固吸附色谱。硅胶柱的分离主要利用生物碱的碱性不同，与生物碱的p Ka值有关，而与生物碱亲脂性的大小无关。正相高效液相色谱常用的流动相为：二氯甲烷（或三氯甲烷、乙醚、异丙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯）-甲醇（或异丙醇）-氨水（约为流动相的1％）。在流动相中加入氨是为了中和硅胶的弱酸性，从而避免拖尾现象。

5.气相色谱法

气相色谱法用于生物碱类成分的含量测定，只适用于有挥发性且热稳定的生物碱类成分。如麻黄碱、槟榔碱、苦参碱等。对挥发性生物碱成分进行气相色谱分析时，供试品溶液在提取、纯化过程要避免加热，以防成分被破坏或挥发，最后需用三氯甲烷等亲脂性强的有机溶剂为溶剂制备供试液。

6.毛细管电泳法

毛细管电泳法在中药成分分析中的应用虽起步较晚，但发展迅速，在生物碱类成分分析中已有较多应用。生物碱能解离正电荷，根据生物碱类成分p Ka值的不同，可采用毛细管区带电泳模式分离结构相似的生物碱。在分析时，除可根据生物碱类成分p Ka值的不同选择缓冲液pH值外，还可根据结构上的细微差异适当加入一些试剂以增强选择性和分离度。