第二节　生物样本收集

在进行生物科学研究时，往往需要对各种生物样品进行处理，以获得目标分析物。样本采集之前要全面考虑采集样本类型、时间、数量、可操作性等多方面因素。所要采集的样本类型主要取决于样本的研究用途，样本该如何采集、处理取决于样本类型和样本来源。在科学研究过程中，往往最容易忽略的就是最基础的样本收集步骤。

一、样本收集基本原则

生物样本的收集，应以尽可能少的步骤、尽可能短的时间获得尽可能多的目标产品，并遵循以下原则：

1.代表性和一致性原则

实验组与对照样本在取材部位、时间、处理过程等方面尽可能保持一致，从而保证实验的可信度。

2.迅速性原则

样本质量是影响实验结果的重要因素，最大限度地缩短样本从采集到实验的时间。

3.低温性原则

所取样本离体后，如有分离步骤应在4℃或冰上等低温条件下进行，分离好的样本立即置于液氮、干冰或-80℃冰箱中，并保证在实验前始终处于-80℃以下，以免样本产生进一步代谢活动。

二、样本收集方法

（一）细胞

细胞是生物体结构和生理功能的基本单位。通过体外培养技术获得足够的细胞，可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学、肿瘤学及临床治疗等多种学科的研究工作，也是开展生物医学研究的重要样本来源。

1.贴壁细胞

（1）DNA收集操作步骤

1）显微镜观察贴壁细胞，确认细胞状态良好。

2）去除细胞培养液，用3～5mL PBS洗涤1～2次，彻底去除PBS溶液。

3）用胰酶消化后，1 000rpm，室温离心10min，用PBS洗涤沉淀2次后，收集细胞。

4）使用油性记号笔标记清楚样本信息。

5）直接抽提DNA或转移至-80℃冰箱中保存。

（2）RNA收集操作步骤

1）显微镜观察贴壁细胞，确认细胞状态良好。

2）去除细胞培养液，用3～5mL预冷的PBS（RNase free）漂洗1～2次，彻底去除PBS溶液。

3）按每10cm²培养面积加1mL Trizol试剂的比例加入Trizol试剂（一般实验建议细胞量为1×10⁶个，约需要1mL Trizol）。

4）将Trizol覆盖培养瓶表面的所有细胞，静置10min，以进行充分消化。

5）将细胞裂解液转移到1.5mL的RNase-free EP管中。

6）使用油性记号笔标记清楚样本信息。

7）转移至干冰或-80℃冰箱中保存。

（3）蛋白质收集操作步骤

1）从贴壁细胞培养瓶中小心弃去培养液。

2）预温的PBS清洗贴壁细胞2次，小心弃去PBS。

3）配制含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1mL抽提试剂中加入5µL蛋白酶抑制剂混合液、5µL PMSF和5µL磷酸酶抑制剂混合液）。

4）细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（10⁷个细胞中加入1mL抽提试剂；5×10⁶个细胞中加入0.5mL抽提试剂），轻轻摇动5min。

5）用塑料细胞刮将培养瓶壁上的贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动15min进行裂解。

6）裂解液置于预冷的离心机中14 000 rpm、4℃离心15min。弃去沉淀，上清液立刻转移至新的离心管中保存待用。

2.悬浮细胞

（1）DNA收集操作步骤

1）显微镜观察，确认悬浮细胞状态良好。

2）将悬浮细胞收集至15mL离心管，离心（1 000rpm，5min）去除培养液。

3）将保留的细胞用PBS缓冲液快速洗2遍，离心（1 000rpm，5min）除去上清液，收集细胞至冻存管中。

4）使用油性记号笔标记清楚样本信息。

5）抽提DNA后直接转移至-80℃冰箱中保存。

（2）RNA收集操作步骤

1）显微观察，确认悬浮细胞状态良好。

2）将悬浮细胞收集至15mL离心管，离心（1 000rpm，5min）去除培养液。

3）将保留的细胞用PBS（RNase free）缓冲液快速洗2遍，离心（1 000rpm，5min）弃去上清液，收集细胞。

4）按照每1×10⁶个细胞加1mL Trizol试剂的比例加入Trizol试剂。

5）将细胞裂解液转移到1.5mL的RNase-free EP管中，室温静置裂解10min，裂解液澄清且不黏稠的状态为好。

6）使用油性记号笔标记清楚样本信息。

7）转移至干冰或-80℃冰箱中保存。

（3）蛋白质收集操作步骤

1）将悬浮细胞收集至15mL离心管，离心（1 000rpm，4℃，5min）去除培养液。

2）将沉淀细胞团用PBS（RNase free）缓冲液快速洗2次，离心（1 000rpm，4℃，5min）除去PBS缓冲液，收集细胞。

3）按照一定比例配制蛋白质抽提试剂，通常RIPA裂解液与PMSF（蛋白抑制剂）的比值应为100∶1。

4）加入含抑制剂的预冷蛋白质抽提试剂（10⁷个细胞中加入1mL抽提试剂，5×10⁶个细胞中加入0.5mL抽提试剂）。

5）轻轻摇动混匀，静置15min，充分裂解。

6）裂解液置于预冷的离心机中，14 000rpm，离心15min。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中，-80℃冰箱保存待用。

（二）组织

从活体动物获取新鲜组织后，剔除脂肪、结缔组织等非研究需要的干扰组织，预冷PBS溶液快速清洗组织块表面的污物和表面液体。尽快用预冷的干净器械，将组织分割成50～100mg的小块（即黄豆大小），放入RNasefree的冻存管中。有条件的最好先用液氮速冻3～4h。-80℃低温保存（长期保存建议转移至液氮罐中）。

1.DNA收集

（1）实验原理

DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚、氯仿、异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。

（2）实验步骤

1）组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5g组织，放入1.5mL离心管中，剪碎。

2）加入0.45mL TE缓冲液混匀，再加入50µLSDS（10%），5.0µL蛋白酶K（20mg/mL），充分混匀后，于56℃保温4～6h，每2h摇1次。

3）放置到室温，加入等体积饱和酚（500µL），颠倒混匀，10 000rpm，离心10min，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，转移到一个新的1.5mL离心管。

4）加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），颠倒混匀，10 000rpm，离心10min，取上层液转移到新的1.5mL离心管中。

5）加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1），颠倒混匀，10 000rpm，离心10min，取上层清液到一个新的1.5mL离心管。

6）加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇沉淀DNA，观察现象。

7）12 000rpm，离心10min，弃乙醇。

8）加入-20℃保存的75%乙醇洗涤，10 000rpm，离心5min，去乙醇，55℃干燥DNA。

9）加入适量TE缓冲液溶解DNA（具体依据DNA的多少而定），-20℃保存备用。

（3）注意事项

1）抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。

2）取上层清液时，注意不要吸起中间白色的蛋白质层。

3）乙醇漂洗过程不要荡起DNA。

4）离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。

2.RNA收集

（1）实验原理Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液，其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性，随后加入氯仿，酚会大量溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中，RNA则分布在上层的水相中，最后用异丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗涤沉淀，这样就可以得到比较纯净的总RNA。

（2）实验步骤

1）准确切取所需部位50～100mg小块组织（即黄豆大小）。

2）在预冷RNase-free的0.9%生理盐水中迅速漂洗样品，以去除血渍和污物。

3）在研钵中加入液氮，再将组织放入液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1mLTrizol液的EP管中（注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。

4）室温放置5min，然后加入200µL氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15s。

5）12 000rpm离心10min，取上层水相到新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12 000rpm离心10min。

6）小心弃去上清液，加入1mL75%乙醇，涡旋混匀，4℃、7 500rpm离心5min。重复操作一次。

7）弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30µL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并置于-80℃冰箱中保存。

（3）注意事项

1）组织样品离开活体后，建议在低温环境下于30min内完成以上组织处理，操作时间越长，RNA降解越严重。

2）如果使用商业RNA保护试剂保存组织样品（如RNAlater，是一种液态无毒的RNA保存试剂），请严格按照试剂说明书进行操作。

3）如果使用Trizol裂解液保存送样，需要先进行组织液氮研磨，然后将组织粉末加入Trizol中彻底裂解（使细胞充分裂解，才能使RNA完全处于Trizol的保护下，保存时间也才会更长）。一般建议50～100mg组织加入1mL Trizol裂解液。常温裂解15min后（此步不可省略），-80℃低温保存，干冰加安全泡沫盒运输。

3.蛋白质收集操作步骤

（1）准确切取所需部位的组织，最好切取细长薄块组织放入管中并称重。

（2）按照一定比例配制蛋白质抽提试剂，通常RIPA裂解液与PMSF（蛋白抑制剂）的比值应为100∶1。

（3）加入预冷的含蛋白质抑制剂的蛋白质抽提试剂（250mg组织中加入1mL抽提试剂）。

（4）用匀浆器每次30s低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1min，至组织完全裂解。

（5）4℃、14 000rpm，离心15min，取上清液立刻转移到新的1.5mL EP管中。

（6）-80℃冰箱中保存备用。

（三）全血

全血由液态的血浆和有形的血细胞组成。根据收集的条件不同，分为不抗凝和抗凝两种，离心后与之对应的离心成分也有差别（图1-1）。

通常认为用于PCR的全血标本首选乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，而不能使用肝素抗凝。因为肝素是一种含有较丰富硫酸基团的黏多糖硫酸酯，分子量为5 000～15 000，溶于水，不溶于有机溶剂，带有强大的负电荷。这些理化性质决定了肝素在全血DNA或RNA抽提过程中，不能被酚、氯仿去除，亦不能被乙醇沉淀、洗涤去除，从而不可避免地被带入PCR反应体系。肝素是Taq酶的强抑制剂，对RT-PCR反应具有抑制作用。

1.DNA收集操作步骤

（1）用（非肝素钠）抗凝管采集血液样本。

（2）分装到1.5mL的离心管。

（3）使用油性记号笔标记清楚样本信息。

（4）转移至-80℃冰箱中保存。

2.RNA收集操作步骤

（1）方法一：

①用（非肝素钠）抗凝管采集血液样本；②取250µL全血移至1.5mL EP管中，加入750µL Trizol LS（裂解液），立即反复颠倒摇匀；③使用油性记号笔标记清楚样本信息；④室温均匀裂解10min后，转移至-80℃冰箱中保存。

（2）方法二：

①用抗凝管（非肝素钠）采集血液样本；②取抗凝血2mL加2mL PBS稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有6mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内（注意勿与分离液混合，然后3 000rpm、4℃离心20min；③管内分为4层，自上而下依次为血浆、单个核细胞、颗粒白细胞、红细胞。用巴氏管伸至单个核细胞层中（位于细胞分离液与血浆的界面上），沿管壁轻轻吸出全部细胞至15mL离心管中；④用PBS缓冲液2mL洗2次，每次1 000rpm、4℃离心，弃上清，加入250µL PBS缓冲液重悬细胞；⑤将细胞悬液250µL移至1.5mLEP管中，加入750µL Trizol LS（裂解液），立即反复颠倒摇匀；⑥使用油性记号笔标记清楚样本信息；⑦室温均匀裂解10min，转移至-80℃冰箱中保存。

（3）方法三：

①采用PAXgene Blood RNA Tube采集全血；②采集血液后立即上下颠倒10次以上混匀；③使用油性记号笔清晰标记样本信息；④室温放置至少2h，转移至-80℃冰箱中保存。

（四）血浆

血浆是全血收集后加入含抗凝剂管抗凝，离心后的上清液。为获得血浆进行实验，应使血抗凝管采集全血，2h内分离血浆。

1.DNA收集操作步骤

（1）用（非肝素钠）抗凝真空采血管采集血液样本，轻轻倒转采血管混合，2h内进行血浆分离。

（2）3 000rpm、4℃离心10min，收集上清至1.5mL/2mL管。

（3）使用油性记号笔标记清楚样本信息。

（4）转移至-80℃冰箱中保存。

2.RNA收集操作步骤

（1）用（非肝素钠）抗凝真空采血管采集血液样本，轻轻倒转采血管混合，2h内进行血浆分离。

（2）3 000rpm、4℃离心10min，收集上清，分装至1.5mL/2mL管（RNase-free）。

（3）加入3倍体积的Trizol（裂解液），立即用力摇匀。

（4）使用油性记号笔标记清楚样本信息。

（5）裂解液均匀裂解10min，转移至-80℃冰箱中保存。

（五）血清

血清是全血收集后待其凝结，离心后的上清液。为获得血清，应使用真空干燥管收集全血，采血后2h内分离血清。

1.DNA收集操作步骤

（1）用真空采血管（不抗凝）采集血液样本，37℃（或室温）静置1h凝固分层。

（2）3 000rpm、4℃离心10min，收集上清，分装至1.5mL/2mL管。

（3）使用油性记号笔标记清楚样本信息。

（4）转移至-80℃冰箱中保存。

2.RNA收集操作步骤

（1）用真空采血管采集血液样本，37℃（或室温）静置1h凝固分层。

（2）3 000rpm、4℃离心10min，收集上清，按0.25mL/管分装至1.5mL/2mL管。

（3）加入3倍体积的Trizol（裂解液），立即用力摇匀。

（4）使用油性记号笔标记清楚样本信息。

（5）裂解液均匀裂解10min后，转移至-80℃冰箱中保存。

（六）外泌体

1.DNA收集操作步骤

（1）收集待分离外泌体的血清/血浆4mL，体液或细胞培养液20mL。

（2）3 000rpm、4℃离心10min，去除样品中的杂质等物质。

（3）吸取上清，使用油性记号笔标记清楚样本信息。

（4）转移至-80℃冰箱中保存。

2.RNA收集操作步骤

（1）收集待分离外泌体的血清/血浆4mL，体液或细胞培养液20mL。

（2）按自己摸索的方法进行外泌体分离。

（3）向外泌体沉淀中加入少于500μL PBS（RNase free）缓冲液，混匀。

（4）加至装有5倍体积Trizol（裂解液）的管中，立即用力摇匀。

（5）使用油性记号笔标记清楚样本信息。

（6）裂解液室温均匀裂解10min后，转移至-80℃冰箱中保存。

（七）电镜样本

1.细胞收集

（1）将细胞收集至15mL离心管，离心（1 000rpm，4℃，5min）去除培养液。

（2）将细胞转移至1.5mL EP管，用PBS缓冲液快速洗1次，离心（1 000rpm，4℃，5min）除去PBS缓冲液，收集细胞（≥10⁵个）。

（3）用3%戊二醛（0.1mol/L PBS，pH 7.2）1mL，室温固定5～6h，后转移至4℃保存。

2.组织收集

（1）准确切取所需部位的组织，分割成大小为1mm×1mm小块。

（2）预冷0.9%生理盐水中迅速漂洗样品，以去除血渍和污物。

（3）用固定材料体积10倍的3%戊二醛（0.1mol/L PBS，pH 7.2），室温固定5～6h，后转移至4℃保存。

3.注意事项

取材时先整块组织放入固定液中，之后用锋利的双面刀片分割，不能撕扯材料，分割成1mmx1mm的小块，置于3%戊二醛固定液中约20min，让材料沉入固定液中。