第二节　动物模型的分类

实验动物模型的分类原则：既要考虑到足够的广度和深度，又要尽可能涵盖目前所知的疾病模型类型。为此，实验动物模型将按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类进行分类。Ⅰ类：按模型制作方法分类。包括自发性、诱导性、基因工程，其中根据不同制作方法可再进行亚类划分。Ⅱ类：按临床疾病分类。Ⅲ类：以模型动物种类和品系为原则进行分类。如小鼠、大鼠、犬、猪、非人灵长类等。

一、按动物模型产生的原因分类

（一）自发性动物模型

自发性动物模型（naturally occurring or spontaneous animal model）是指实验动物未经任何人工处置，自然条件下发生的疾病，或由于基因突变的异常表现，或在解剖结构上与人体天然不同，或天然抵抗某种病原体感染等，经定向培育、能稳定遗传保留下来的疾病模型。

1.自发肿瘤模型

指实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下发生肿瘤的动物模型。近交系动物在培育过程中因其携带的有害隐性基因暴露，近亲衰退出现，使得自发肿瘤增加。实验动物常见自发肿瘤见表1-1。

2.先天或获得性免疫缺陷动物模型

指由于先天性遗传突变或获得性（或继发）免疫缺陷造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物模型。

（1）裸小鼠：

1962年英国格拉斯哥医院，Grist在非近交系的小鼠中偶然发现有个别无毛小鼠，四年后，爱丁堡动物研究所的Flanagan证实这种无毛小鼠是第Ⅷ连锁群（linkage group）内裸体位点的等位基因（nu基因）发生纯合突变而形成的突变小鼠，有先天性胸腺缺陷。目前已将nu基因导入不同近交系动物，培育了系列动物模型，仅小鼠模型就已建立20余种，其中BALB/c，C3H/He，C57BL/6是三种常用的近交系无胸腺裸小鼠（inbred nude mice），共同特点是繁殖率低下，对疾病抵抗力差。后来，将近交系BALB/c裸鼠和NIH瑞士种小鼠交配，获得远交系无胸腺裸小鼠（outbred nude mice），克服了近交系无胸腺裸小鼠的缺点，可以大量繁殖。随着近代医学发展，裸小鼠已成为医学生物学研究领域中不可或缺的实验动物模型，特别是在肿瘤学、遗传学、免疫学、微生物学、内分泌学和老年学等领域的研究、药品与生物制品的安全性评价等方面有着特殊的价值。

（2）SCID小鼠：

即重度联合免疫缺陷小鼠（severe combined immune deficiency，SCID）。1983年美国Bomsa在近交系C.B-17小鼠中发现该小鼠第16号染色体上的Scid单个隐性基因突变，胸腺、脾、淋巴结的重量不及正常的30%，胸腺多被脂肪组织包围，无皮质结构，仅残存髓质，组织学上表现为淋巴细胞显著缺陷，小肠黏膜下和支气管淋巴结较少见淋巴结内无淋巴细胞聚集，但有正常的NK细胞、巨噬细胞和粒细胞。SCID小鼠是继裸鼠之后另外一种十分有价值的免疫缺陷动物，在肿瘤学、免疫学、微生物学和生殖医学等领域得到广泛应用。

（3）NOD/Lt小鼠：

来源于ICR/Jcl。在对ICR/Jcl小鼠进行近交培育的第6代，从白内障易感亚系分离出非肥胖糖尿病品系（non-obese diabetes，NOD）和非肥胖正常品系（non-obese normal，NON）。在近交第20代时，首先发现NOD雌鼠有胰岛素依赖性糖尿病。30周龄时NOD/Lt小鼠糖尿病累计发病率雌雄分别为60%～80%和10%～70%，睾丸切除可增加糖尿病发病，而卵巢切除减少发病，临床症状与人类1型糖尿病类似。NOD/Lt小鼠于90～120日龄（相当于人类青春期）发病，有下列症状：酮尿、糖尿、高血糖、血胆固醇过多、烦渴、多尿、贪食。糖尿病发病与免疫系统异常有关。在内分泌学研究中得到广泛应用。

（4）NOD/SCID小鼠：

SCID小鼠与非肥胖性糖尿病小鼠（NOD/Lt）品系回交，获得NOD/SCID（非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷）免疫缺陷小鼠。与普通SICD小鼠相比，其NK细胞活性低，具有更低的免疫恢复概率。在肿瘤学、免疫学、微生物学和生殖医学等领域得到广泛应用。

（5）NSG小鼠：

利用CRISPR/Cas9系统直接对 NOD/SCID小鼠进行Rag2和IL2rg双基因敲除而获得的小鼠。与 NOD/SCID小鼠相比，NSG小鼠的人体细胞和组织移植存活率显著提高，同时，能够植入更高比例的正常或癌变人类细胞和组织。此外，NSG小鼠还能满足作为人类免疫系统模型的需求，植入人类造血干细胞后，NSG小鼠的外周淋巴组织可以产生人类 T 细胞。NSG小鼠也可以作为人类细胞和器官的移植模型、肿瘤移植模型，便于医学研究和新药研发。

（6）NOG小鼠：

日本实验动物研究所（CIEA）的Mamoru Ito博士通过杂交NOD/SCID小鼠进行γ链IL2受体基因敲除而获得的免疫功能缺陷小鼠。与NOD/SCID小鼠相比，NOG小鼠的人体细胞和组织移植存活率显著提高，同时，能够移入更高比例的正常或癌变人类细胞和组织。应用于人类肝病、传染病、肿瘤研究。

（7）NPG小鼠：

国内研发的NPG/Vst与国外的NSG或NOG一样，均为NODPrkdcscid Il2rgnull小鼠，其巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱；先天免疫系统，如补体系统和树突状细胞功能降低。小鼠缺失功能性的T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷，是目前国际公认的免疫缺陷程度最高、最适合人源细胞移植的小鼠。

（8）CBA/N小鼠：

带有性连锁隐性xid基因（x连锁免疫缺陷基因），动物脾脏中的B淋巴细胞数目减少，不能产生抗体以应答非胸腺依赖性抗原。对T细胞非依赖性Ⅱ型抗原（TI-Ⅱ抗原：聚蔗糖ficoll、右旋糖酐dextran、肺炎球菌多糖体等）不能产生抗体应答，而对T细胞非依赖性Ⅰ型抗原（TI-Ⅰ抗原：布氏菌脂多糖等）呈正常反应。CBA/N小鼠可作为人的湿疹-血小板减少-免疫缺陷综合征的模型动物。

（9）Beige（bg）小鼠：

在第13号染色体上的隐性遗传基因bg发生突变引起小鼠内源性NK细胞、巨噬细胞发育和功能缺陷，细胞毒性T细胞功能缺乏。其免疫抗肿瘤杀伤作用出现较晚，对同种、异种肿瘤细胞的体液免疫功能减弱，巨噬细胞的抗肿瘤活性、杀伤细胞活性等欠缺。溶酶体功能缺陷，对各种致病因子较敏感，需要良好的无特定病原（specific pathogen free，SPF）环境，应用于免疫学领域。

（10）裸大鼠：

由英国罗威特（ROWett）研究所在1953年首次发现，基因符号为mu，但在普通环境下仅仅维持了15～16代。1975年再次发现纯合子裸大鼠，证实属常染色体隐性遗传。先天无胸腺、T淋巴细胞功能缺陷，B淋巴细胞功能正常，NK细胞活力增强。裸大鼠是肿瘤学和免疫学研究常用的动物模型。

3.其他自发突变动物模型

分为代谢性疾病、分子性疾病、特种蛋白合成异常疾病等动物模型。如在KK小鼠品系背景上，发生Agouti（A）基因突变，突变基因导入一个小鼠品系，形成KK-Ay肥胖小鼠模型。在C57BL/6J小鼠品系背景下，发生leptin基因点突变，导致leptin信号通路障碍，从而体内不能产生瘦蛋白（leptin），形成ob/ob和db/db肥胖小鼠模型。Zucker在1961年发现的fatty基因（fa）常染色体隐性遗传突变，形成Zucker大鼠肥胖模型。此外，还有高血压模型、糖尿病模型、肥胖并糖尿病模型。

总之，由于自发性动物模型是动物未经人为因素处理而自然发生的疾病，因此，它与人类疾病有较好的相似性，是一类珍贵的动物模型，如自发性高血压大鼠、肥胖症小鼠、脑卒中大鼠等。但是，这类动物模型来源比较困难，种类有限。某些动物自发性肿瘤模型因实验动物品种、品系不同，其肿瘤所发生的类型、发生率和发病机制也有差异。

（二）诱发性动物模型

诱发性动物模型（experimental animal model）又称为实验性动物模型，指通过物理、化学、生物等致病因素或复合致病因素人为造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现具有类似人类疾病特征（功能、代谢或形态结构）的动物模型。诱发性动物模型适用于各类疾病病因和发病机制的研究、候选药物活性的筛选、药物临床前主要药效学和毒理学评价等。

1.物理因素

包括烧伤、烫伤、冷冻损伤、气压损伤、噪声损伤、闪电损伤、射线损伤、机械损伤（冲击、撞击）、旋转损伤、手术损伤等。如大鼠在戊巴比妥钠麻醉下进行双侧睾丸切除术可制备去势模型；大鼠部分结扎左肾静脉可制备精索静脉曲张模型；大鼠阴茎根部内荷包缝合或阴茎包皮折叠缝合制备隐匿阴茎动物模型；外科手术方法复制大鼠急性肝衰竭动物模型和大鼠肺水肿动物模型；放射线复制大鼠萎缩性胃炎动物模型以及大鼠、小鼠、犬的放射病模型等。采用物理因素复制动物模型比较直观、简便，是较常见的方法。

2.化学因素

包括化学致癌物质、强酸强碱、营养物质增加或减少等。如大鼠颈部背侧皮下注射阿扑吗啡，可建立糖尿病大鼠模型。采用醋酸法可以建立消化性溃疡模型。不同动物用四氧嘧啶和链佐霉素制备糖尿病模型的给药方法见表1-2。常用大鼠化学致癌物诱发恶性肿瘤模型的方法见表1-3。

3.生物因素

包括病原体、组织块、细胞株等。

（1）人畜共患病病原：

即指在脊椎动物与人类之间自然传播的、由共同的病原体引起的、流行病学上又有关联的一类生物体。一是细菌病，包括结核病、炭疽、布鲁菌病、鼠疫、链球菌病、大肠埃希菌病、沙门菌病；二是病毒病，包括狂犬病病毒、禽流感病毒、莱姆病毒、疯牛病病毒、艾滋病病毒、禽流感病毒、埃博拉病毒、出血热病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒病、轮状病毒病、汉坦病毒感染等。三是寄生虫病，包括原虫病、线虫病、吸虫病、绦虫病、疥螨病等。例如，采用180～240g Wistar大鼠，乙醚麻醉后垂直固定，显露声门，用12号钝头针头将1ml肺炎克雷白杆菌混悬液（含细菌量1×106cfu）注入气管内，保持垂直体位5 min，可建立肺炎克雷白杆菌肺炎模型。

（2）传染性疾病：

甲类传染病包括鼠疫、霍乱。乙类包括传染性新型冠状病毒肺炎、非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰质炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血热、狂犬病、流行性乙型脑炎、登革热、炭疽、细菌性和阿米巴性痢疾、肺结核、伤寒和副伤寒、流行性脑脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生儿破伤风、猩红热、布鲁菌病、淋病、梅毒、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾。丙类包括流行性感冒、流行性腮腺炎、风疹、急性出血性结膜炎、麻风病、流行性和地方性斑疹伤寒、黑热病、包虫病、丝虫病，除霍乱、细菌性和阿米巴性痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻病。

（3）组织块：

将人子宫内膜碎片经腹腔注入SCID小鼠，可建立子宫内膜异位（EMT）模型。将VX2鳞癌组织匀浆后注入兔背部皮内，可复制出兔移植性皮肤肿瘤模型。选取患者未发生坏死、具有活性的新鲜肿瘤组织，移植到重度免疫缺陷（T、B细胞缺失，NK细胞功能受损）小鼠（如NSG小鼠、NPG小鼠）皮下，可建立胶质瘤小鼠模型。

（4）细胞株：

在小鼠膀胱壁内及后腿皮下接种小鼠BTT T739膀胱癌细胞株，可建立高转移膀胱癌模型。4～6周龄雄性裸鼠臀部皮下注射200μl肝癌细胞Hep3B悬液（3×106/0.2ml PBS），可建立肝移植瘤小鼠模型。人的肿瘤均可建立相应疾病的动物模型（表1-4）。

总之，由于诱发性动物模型可在短时间内复制出大量疾病模型，并可严格控制各种条件使复制出的动物模型适合研究目的需要，具有制作方法简便、实验条件简单、影响因素容易控制等特点，成为近代医学研究特别是药物筛选中的首选。但诱发性模型和自发性模型在某些方面毕竟存在一定差异，在设计诱发性动物模型时要尽量克服其不足，发挥其特点。另外，尚有不少人类疾病至今未能用人工方法复制，需进一步研究。

（三）基因工程动物模型

基因工程动物模型（genetic engineered animal model）是指通过基因工程技术人为修饰、改变或干预生物原有的遗传组成，导致新的遗传性状的出现，并能稳定有效遗传的动物品系，又称基因修饰动物。其目的是在DNA水平改造模式生物，模拟人类疾病、观察生理或病理改变，在基因功能研究、疾病致病机制研究和药物筛选研究中起着至关重要的作用，已成为比较医学研究的重要工具。

1. 转基因动物模型（transgenic animal model）

指用实验方法将外源基因稳定整合到动物基因组中，并能稳定地遗传给下一代动物。转基因动物应具备三个条件：一是外源基因必须整合到动物基因组中；二是外源基因必须在特定的组织和发育阶段表达；三是所有转移基因必须能稳定遗传给后代。目前，最常见转基因动物制备方法有以下三种：

（1）显微注射法：

将重组DNA分子以显微注射的方式导入单细胞卵的原核中，再将它植入假孕母鼠。大约20%的显微注射胚胎能够将外源基因整合到染色体基因组上，大多数的转基因动物能够将整合的基因传给后代，建立起转基因鼠系（图1-1）。

（2）反转录病毒感染法：

用携带外源基因的高滴度重组病毒，感染发育早期的胚胎，再将感染病毒后的胚胎植入假孕母鼠。

（3）胚胎干细胞法：

从哺乳动物胚胎中分离出ES细胞，通过转导或转染的方法，将外源基因转入ES细胞，再以显微注射的方式将其植入鼠的胚胎。

2. 基因敲除动物模型（gene knockout animal model）

利用基因工程技术，将动物基因组中的特定基因片段替换或插入灭活，造成该基因表达缺失或关闭，并且这些缺失或关闭基因能够稳定地遗传给下一代。广义的基因敲除包括基因全部敲除、部分敲除和基因调控序列的敲除。基因敲除技术主要包括以下几种。

（1）Cre/Loxp技术：

即一种条件性基因敲除技术。该系统含有两种成分：一种是一段长34bp的DNA序列，含有两个13bp的反向重复序列和一个8bp的核心序列，被称为loxP位点。另一种是来源于F1噬菌体，由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组，被称为Cre重组酶（cyclizationrecombination）。任何位于两个LoxP位点之间的DNA序列，在Cre重组酶的作用下，要么被缺失（两个LoxP位点的方向相同），要么方向发生倒转（两LoxP位点的方向相反）（图1-2）。

Cre/Loxp系统具有以下特点：①时间和空间的特异性：如果将Cre结构基因置于某一特定的启动子或其他调节基因控制之下，便会实现Cre酶蛋白在特定组织和特定时间的可控型表达，继而限定了重组发生的时空性；②高效性：重组不受切除片段长短及位置影响，可以在活体动物体内实现，可随细胞分裂和动物传代稳定遗传；③准确性：在动物模型中，至今未发现Loxp位点之外的非特异性重组；④快速性：动物实验已证实，在受精卵分裂之前的短时间内，便会完成Cre介导的特异性重组。

Cre/Loxp系统可以使某一基因只在特定的组织、细胞及细胞分化、成熟过程中的某一时段被剔除，这样减少了对系统发育的副作用。如用αMyHC启动子来调控Cre蛋白表达制成转基因鼠，再与心肌细胞缝隙连接蛋白43（Connexin43，Cx43）基因两侧有Loxp靶位点的转基因鼠杂交，可以获得心肌细胞无Cx43特异性表达的子代鼠，成功制造心衰实验鼠动物模型。同样，如将Cre置于乳腺组织特异性表达的乳浆酸性蛋白（whey acidic protein，WAP）基因的启动子的调控之下，则可以制成乳腺组织Cre特异性表达鼠，可以用来针对性地剔除乳腺组织中一些与乳腺癌相关的原癌基因或抑癌基因如BrcaI，P53基因的表达，而对乳腺组织之外的其他脏器没有影响。利用Cre/Lo xp系统， 已经成功获得巢蛋白（nestin）启动子控制下的神经干细胞和神经前体细胞特异性的肿瘤抑制因子Pten（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten，Pten）基因剔除鼠、大鼠胰岛素启动子控制下的胰腺β细胞特异性Smad2基因剔除模型、载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）启动子控制下的阴离子蛋白megalin在肾脏的特异性剔除模型等。

（2）锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）技术：

由锌指蛋白和非特异性核酸内切酶（FOK Ⅰ）组成的融合蛋白，其锌指结构域特异识别靶位点两端DNA，同时依赖FOK Ⅰ的作用切割相应双链DNA，从而导致双链DNA 断裂（图1-3）。与传统基于同源重组的基因打靶相比，ZFNs技术能使打靶效率提高100 000倍，并使基因断裂与突变修复达到同样效果。ZFNs技术已经应用于多种生物，包括昆虫、两栖类生物、线虫、植物、多种动物和人类细胞。如直接注射编码ZFNs mRNA进入果蝇单细胞胚胎，建立基因敲除动物。通过显微注射注入斑马鱼单细胞期胚胎，产生了Nt 1基因位点突变的斑马鱼，并且这种突变能传递给后代。显微注射ZFNs质粒片段或mRNA进入大鼠单细胞胚胎，将大鼠基因组中的外源基因GPF和2个内源性基因成功进行了突变，效率达到20%，并获得了能将表型通过生殖系遗传的大鼠。将公猪成纤维细胞共转染针对PPARγ基因的ZFNs和1个Neo抗性基因表达框，成功获得了杂合子基因敲除猪。ZFNs技术已成为一种生产转基因动物、细胞系的有力工具，为动物模型的建立提供了一种快速而有效的途径；同时，ZFNs技术在人类疾病治疗中也发挥着重要作用。

（3）TALEN（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技术：

基于TAL与人工改造的核酸内切酶的切割域（FokI），构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，通过TAL的DNA识别域结合到靶位点上，与FokI切割域形成二聚体，可特异性地切断目标DNA序列。在随后的非同源末端连接修复过程中，断开的DNA双链会因为碱基的随机增减而以一定的概率实现目标基因功能的缺失（图1-4）。

TALEN技术克服了常规的ZFNs方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，同时又具有ZFNs同等或更好的活性，使基因操作变得更加简单、方便。TALEN技术已经成功应用到了细胞、植物、酵母、斑马鱼、小鼠、大鼠、猪和猴等各类研究对象，成为动物模型建立的良好工具，广泛用于基因功能、疾病分子机制、基因工程异种移植器官、药物评价的人源化模型和提升工农业生产水平等研究。

（4）CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9（CRISPR-asso ciated，Cas）技术：

由RNA指导Cas 核酸酶对特定基因序列进行DNA修饰的技术。CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在不断进化过程中形成的一种适应性免疫防御机制。在此技术系统中，CRISPR对特定DNA的识别是由crRNA或向导RNA通过碱基互补配对，定向寻找目标DNA序列。靶定目标序列后，Cas9蛋白负责对目标DNA进行剪切，造成靶DNA双链断裂。在随后的非同源末端连接修复过程中，断开的DNA双链会因为碱基的随机增减而以一定的概率实现目标基因功能的缺失（图1-5）。

目前有三种方法介导CRISPR，以实现体内基因编辑。第一种方法是病毒输送的方式：包括腺病毒、慢病毒和腺相关病毒（AVV）。腺病毒能够同时感染分裂期和非分裂期细胞，但不将其DNA整合入宿主细胞基因组，在哺乳动物中能引发强烈的免疫应答。腺病毒介导的Cas9已用于小鼠肺和肝脏的基因组编辑。慢病毒能够感染非分裂期的细胞，包装的DNA限制是3～8.5kb，利用慢病毒已成功将Cas9 DNA和sgRNA输送到小鼠中，表达的抑癌基因对肺癌有治疗作用。AVV与腺病毒一样，可以感染分裂期和非分裂期细胞，不会将其DNA整合入宿主细胞基因组，与腺病毒不同的是它不引起显著的免疫应答。与慢病毒相比，AVV包装的DNA限制大约4.5kb，只能分别将SpCas9（3.2kb）基因和sgRNA整合一起，靶DNA、相关启动子和调控序列整合一起，分别构建AAV表达质粒；甚至SpCas9、sgRNA也需单独包装入AVV载体中，构建表达质粒。AAV已被用于小鼠大脑和肝脏中基因编辑。另外一种选择是使用split-intein Cas9 system，将每一半包装入单独的AVV载体中，在共转染后，Cas9-intein半联合并进行蛋白质剪接以产生完整的、共价的Cas9蛋白。2015年，这个系统已经成功介入在培养人和老鼠细胞的基因组编辑的运用。第二种方法是脂质体纳米颗粒介导。阳离子脂质体将带阴离子电荷的RNPs（Cas9/sgRNA ribonucleotide protein complexes/Cas9/sgRNA核糖核苷酸蛋白质复合物）呈递入体内或细胞培养中产生基因组编辑的方法。该方法已被成功运用于小鼠内耳毛细胞和神经元的基因组编辑。第三种方法是直接注射核酸。水动力注射（hydrodynamic injection，HDI）DNA质粒是一种高效，便捷的非病毒传递方式，适用于老鼠的肝细胞基因组编辑。已有研究证明水动力尾静脉注射编码Cas9和sgRNA的DNA质粒成功适用于乙肝病毒感染的小鼠肝脏，通过Cas9/sgRNA复合物剪切HBV病毒DNA，导致HBV病毒表达减少。

3.RNA干扰（RNA interference，RNAi）

指绝大多数真核生物细胞中，外源或内源性短双链RNA（dsRNA）诱导细胞内同源靶mRNA高效特异性降解，使目的基因表达下调、沉默，从而实现基因表达调控的时空性和可逆性。

小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）是人工体外合成的小片段双链RNA，由约20个碱基对组成，具有磷酸化5′末端和两个突出核苷酸的羟基化3′末端，siRNA通过转染进入细胞内，可作用于mRNA的任何部位，导致靶基因的降解，即为转录水平后调控。siRNA与microRNA（miRNA，微小RNA）的区别是，后者为长度为22nt左右的5′端带磷酸基团、3′端带羟基的非蛋白编码的调控单链小RNA家族。miRNA是内源性单链RNA，主要作用于靶基因3′非翻译区（3′-UTR），对靶基因mRNA的作用主要取决于它与靶基因转录本序列的互补程度，可抑制靶基因翻译，也可以导致靶基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用。小 发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）是一种形成发夹（hairpin turn）结构的RNA序列，可利用载体导入细胞当中，并借由U6等启动子来确保shRNA的表达。另外，shRNA可经由切割转变成为siRNA。目前，有下面几种表达shRNA的病毒载体，包括：①逆转录病毒载体， 它能够将siRNA表达框整合到分化的细胞基因组中，并能够通过在抗生素选择条件下维持稳定长期的shRNA表达。②慢病毒载体，能感染未分化的细胞和分化末期细胞，感染成功的细胞基因组中将会永远包含shRNA表达框，并能够稳定表达shRNA，产生持久的基因沉默的效果。③腺病毒载体，它能够感染分化和未分化的细胞，但只能在细胞中以一种游离体的形式存在。

RNAi技术有以下几个特点：比同源重组法更加简便、制作周期短、可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术弥补因在哺乳动物进行某个基因敲除后导致小鼠胚胎死亡而不能进行该基因功能分析的缺陷。RNAi能高效特异的阻断基因的表达，已被广泛应用到功能基因组学、药物靶点筛选、细胞信号传导通路分析和疾病治疗等方面。

4.人源化动物模型（humanized animal model）

指携带有功能性的人体基因、细胞或组织的嵌合体实验动物。如带有人基因的转基因动物模型、人肝细胞移植到肝损伤的免疫缺陷小鼠体内建立人肝嵌合小鼠模型（humanized liver mice）、人造血干细胞移植免疫缺陷小鼠的人源化造血/免疫缺陷小鼠（humanized hematopoiesis/immune system mice）、人肿瘤细胞株或肿瘤组织移植瘤动物模型。人源化动物模型为建立难以复制的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和疟疾等人类传染病动物模型及人源化个体化肿瘤模型（patient derived xenograft，PDX）奠定了基础，在传染病学及肿瘤学研究中具有举足轻重的作用。

二、按疾病的系统范围分类

（一）基本病理动物模型

基本病理动物模型（animal model of fundamental pathologic processes of disease）是指各种疾病共同性的一些病理变化过程模型。致病因素在一定条件下作用于动物，使动物组织、器官或全身造成一定病理损伤，出现各种功能、代谢和形态结构的某些变化，其中有些变化是许多疾病共有的现象，如发热、缺氧、水肿、休克、弥散性血管内凝血、电解质紊乱、酸碱平衡失调等。如发热症状动物模型，可以通过化学药品、生物制剂和综合方法诱导。家兔背部皮下注射2%的硝基苯酚（DNP）溶液，30min后家兔体温显著升高，lh后达到峰值，较对照组体温升高1.58℃。大鼠皮下以160mg/kg的剂量注射DNP溶液，体温将升高0.6℃以上。用0.5% CMC-Na（羧甲基纤维素钠）溶解甲状腺素片配制成5mg/kg所需浓度的溶液，对大鼠每日5ml/kg连续给药7d后，可以得到合适的发热动物病理模型。大鼠的双后爪囊跖皮下分别注射1%卡拉胶混悬液0.1ml，也可造成发热模型。以10ml/kg的剂量，给大鼠背部注射15%的酵母菌混悬液，0.5h后其体温上升。

（二）系统疾病动物模型

系统疾病动物模型（animal model of different system disease）是指与人类各系统疾病相对应的动物模型，分为神经、心血管、呼吸、消化、泌尿、生殖、内分泌等系统疾病动物模型。

1.神经精神疾病实验动物模型（animal models of neuropsychiatric disorders）

包括癫痫动物模型、抑郁症动物模型、记忆障碍动物模型、阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）动物模型等。例如，大鼠腹腔注射氯化锂、毛果芸香碱可出现持续性癫痫发作，从而建立癫痫动物模型。应激法、药物法、嗅球切除法以及免疫因子刺激法可建立抑郁症动物模型。侧脑室注射选择性胆碱能神经毒剂AF64A损伤大鼠前脑基底胆碱能神经元，制备AD模型。

2.心脑血管和血液系统疾病实验动物模型（animal model of cardiovascular and vascular diseases）

包括心肌缺血动物模型、心律失常动物模型、高血压动物模型、动脉粥样硬化动物模型等。例如，冠脉结扎法、注射药物诱发冠脉痉挛法、闭胸法等引起兔、豚鼠、大鼠的冠状动脉血流量降低，致使心肌供氧不足以及代谢产物清除减少，均可制备心肌缺血模型。不同动物饲料中添加高胆固醇类物质可以复制动脉粥样硬化斑块。兔每天喂服胆固醇0.3g，连续4个月；大鼠喂服1%～4%胆固醇、10%猪油、0.2%甲硫氧嘧啶、86%～89%基础料，连续7～10d；Gottigen系小型猪喂饲含1%～2%的高脂食物6个月；雄性C57BL/6J小鼠在普通饲料中加5%胆固醇、2%胆酸钠、30%蛋白质，喂养25周，动物均可出现动脉粥样硬化斑块。

3.呼吸系统疾病动物模型（animal model of respiratory diseases）

包括慢性支气管炎动物模型、肺水肿模型、支气管痉挛、哮喘模型等。如大鼠和小鼠吸入氧化氮可造成中毒性肺水肿。兔或犬的气管内注入50%葡萄糖液可引起渗透性肺气肿。豚鼠腹腔注射致敏抗原鸡蛋白溶液可复制急性过敏性支气管痉挛。

4.消化系统疾病动物模型（animal model of digestive diseases）

包括急性胰腺炎实验动物模型、肝硬化动物模型、胆囊炎动物模型、脂肪肝动物模型等。如大鼠胰胆管注射牛磺胆酸钠可复制急性胰腺炎实验动物模型。大鼠腹腔内注射D-氨基半乳糖，约半年之后可形成肝硬化。细菌感染或化学刺激（胆汁成分改变）可致胆囊炎性病变。过量饮酒、长期高糖/高脂饮食、四氯化碳药源性肝损害、乙醇灌胃等方法可制备脂肪肝动物模型。

5.泌尿系统疾病动物模型（animal model of urological diseases）

包括慢性肾小球肾炎动物模型、肾结石、膀胱结石动物模型等。如抗血清法、异种蛋白法、阿霉素法等制备慢性肾小球肾炎模型。膀胱内异物移植、用富含维生素A的食物饲养动物、乙二醇和乙醛酸钠中毒，在肾内形成草酸钙结晶，有利于结石的发生，以建立肾结石模型。

6.生殖系统疾病动物模型（animal models of reproductive diseases）

包括前列腺增生症动物模型、子宫内膜异位症动物模型等。如雄性激素法、胎鼠尿生殖窦植入法等建立前列腺增生模型。

7.内分泌系统疾病动物模型（animal model of endocrine diseases）

包括糖尿病动物模型、甲状旁腺功能亢进症动物模型、甲状腺功能减退症动物模型等。如以化学诱导法、胰腺切除法、高脂/高糖饲料喂饲法建立糖尿病动物模型；高磷饮食诱导法建立原发性甲状旁腺功能亢进动物模型；低碘饲料喂饲法、化学诱导法、甲状腺切除法建立甲状腺功能减退症（甲减症）模型。

三、按动物模型性质分类

（一）整体动物模型

整体动物模型是应用最多的动物模型，包括自发动物模型、诱发动物模型、基因工程动物模型等。整体动物模型能从功能、代谢、结构、行为、病征全面模拟人类疾病发生发展全过程，在生命科学研究中发挥重要作用。

（二）立体组织模型和器官模型

利用人体的组织或器官的特性进行疾病机制或药物评价研究。

1.人源肿瘤类器官模型

近年迅速发展的一种体外3D组织培养技术，在体外高效、快速地培养人的组织细胞，形成保留原器官组织结构和生物信息的“微组织”模型。肿瘤类器官培养技术，通过在体外建立类似体内的微环境，把患者肿瘤组织分离的肿瘤细胞在体外实现3D培养，形成微型肿瘤模型，其组织结构、遗传突变图谱与原肿瘤组织保持高度一致，该模型突破了目前的体外模型不能充分复制肿瘤微环境的三维性和异质性的瓶颈，可以更全面地捕捉癌症的生物学特征，让研究者更好地了解肿瘤的转移和发展。利用该模型可测试肿瘤患者对药物的敏感性，实现个性化的精准医疗。如人体胎盘“类器官”，从妊娠早期（妊娠6～9周）人体胎盘中获得的特定滋养层细胞，体外培养10～14天后就发育成三维“类器官”结构，该“类器官”与生理发育正常的妊娠早期胎盘非常相似，具有典型的胎盘功能特征，可分化形成特定类型的滋养层细胞，发育成绒毛（指状）结构，分泌胎盘特异性激素，包括人绒毛膜促性腺激素（hCG）。人体胎盘“类器官”为妊娠期间发生的生理、代谢和激素变化，为子痫前期、胎儿生长受限、死产等疾病研究提供了实验的功能性模型。除此外，还有人肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌和食管癌等肿瘤类器官模型。

2.正常器官模型

如Draize试验，可利用屠宰场得来的牛眼或者鸡眼角膜进行替代实验。

3.3D生物打印模型

生物工程技术的高速发展为建立体外微环境方面创造了条件。3D打印技术和生物材料研究的共同进步导致了3D生物打印技术的诞生，其复杂性接近于体内器官、组织或肿瘤微环境，体外再现器官、组织和肿瘤在体内的许多已知特征。如利用双光子光刻微纳米3D打印技术制造出了世界迄今为止第一个高精度1∶1脑血管屏障（blood brain barrier，BBB）微流体模 型。除此之外，还有3D打印心脏模型、3D打印胸廓模型、3D打印血管模型、3D打印肺模型、3D打印肝肿瘤模型等。3D生物打印模型对于开发疾病的新疗法以及医学教育至关重要。

4.计算机模型

随着生物信息学的发展，机体内发生的许多生理、生化、病理和毒理过程能用数学方程式表示，能建立数学模型。有机体内许多生理学参数、药物的物理化学特性、药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程也能建立生理学基础的药物动力学（PBPK）模型。大多数情况下，这些模型是在计算机上建立和使用，所以也被称为计算机模型或计算机模拟。计算机模型可以根据受体的三维结构或引起药效的生物过程、特定基团的原子、基团在分子中的位置、电荷等辅助药物设计；可以预测许多类型的药物或新化合物在动物体内的生物活性，包括它们的毒性，或通过引入微小的分子结构变化提高药物的药效；可以对一系列相关的化合物进行筛选和排序，然后剩下少量的药物用动物试验来确定；可以通过数学建模或利用数据库建立的计算机模型达到可验证的定量预测，如对细胞行为进行定量预测并进行检验。目前，数学模型已被应用于医学、药物研发、食品工程、生态学、系统生物学等。如，吸入暴露的毒物动力学模型、血液流动的弹性腔模型。