第三节 细胞凋亡与缺血性心肌病
1772年英国William Heberden医师报道了1例患者行走时出现胸前不适的症状，将其命名为“心绞痛”，发现这种不适症状在休息后症状瞬间消失，再次活动后会复发。这可能是缺血性心肌病的最早报道。缺血性心肌病缘于心肌供氧和耗氧失衡，导致心肌细胞缺氧和代谢物集聚，引起心前区疼痛不适等或轻或重的临床症状，有的不伴有临床症状。在缺血性心肌病的发病过程中常伴有心肌细胞的凋亡，这是多种心血管疾病发病的基础。抑制心肌细胞凋亡可发挥心脏保护作用，并可能逆转早期的心血管疾病。
一、心肌的供、需、耗氧决定因素
生理情况下，心肌耗氧和冠状动脉的供血存在着一定的平衡，运动或其他因素可致心脏代谢增加，心肌细胞供氧也随之增加，以满足机体的需求。以下将从心肌供氧和心肌耗氧两方面阐述其决定因素。
（一）心肌供氧
心肌供氧由血液的携氧能力和冠状动脉的血流量两者决定，前者的决定因素在于血液中血红蛋白的量及其氧合状态。生理状态下，血液的携氧能力是相对恒定的，但在病理状态下，如贫血或肺部疾病时，冠状动脉血流则发生较大变化，可直接影响供氧和代谢需求之间的动态平衡，因此血流量的改变在此动态平衡中扮演着重要角色。冠状动脉因其所处位置的特殊性，在心肌的供氧中发挥重要作用。不同于其他动脉系统的最大血流量发生在收缩期，冠状动脉血液灌注的高峰发生于舒张期。若主动脉舒张压下降，则可直接影响冠状动脉灌注压，引起心肌供血供氧减少。
冠状动脉血管的阻力是影响其动脉血流的一个主要因素。其调控可通过非冠状动脉的外源性压力和冠状动脉的内源性压力来实现。外源性压力的产生是由于心肌收缩时，冠状动脉壁受到心肌的压迫，其压迫的强度与心肌压力呈正相关，心内膜下心肌受到的压力比心外膜下受到的压力更大，因此临床上心内膜下心肌发生缺血性损伤的概率高于心外膜下发生的概率。而冠状动脉内源性压力的调节主要受以下几个方面的影响，①代谢因素：局部的代谢产物可通过不同的方式影响冠状动脉的张力，进而调节心肌的氧供。在缺氧的情况下，线粒体的有氧代谢和氧化磷酸化过程受到抑制，三磷酸腺苷合成受到抑制，因此二磷酸腺苷及一磷酸腺苷集聚并随后分解成腺苷。腺苷可通过与血管平滑肌细胞的受体结合而减少Ca2+内流，引起血管平滑肌细胞舒张，从而起到扩张血管、增加冠状动脉血流的作用。②内皮因子：血管内皮细胞可产生多种扩张或收缩血管的因子，如血管内皮细胞释放一氧化氮（NO），引起胞质中的Ca2+外流，使细胞内游离的Ca2+减少，抑制钙调蛋白介导的肌球蛋白轻链磷酸化，使肌球蛋白与肌动蛋白的结合发生抑制，从而发挥舒张血管的作用。发挥舒张血管作用的内皮因子还包括前列环素、内皮细胞衍生超极化物。而具有收缩血管功能的内皮因子包括内皮素1（endothelin-1，ET-1）和尾升压素Ⅱ（urotensin-Ⅱ，UT-Ⅱ）等因子，特别是ET-1可与组织中相应的受体结合，激活第二信使cGMP，从而继发三磷酸肌醇水平增高并诱导细胞内Ca2+浓度增高，从而发挥着收缩血管的作用。③神经因素：交感和副交感神经也参与到血管的收缩与舒张，尤以交感神经作用最大，如冠状动脉含有α肾上腺素受体与α、β2肾上腺素受体，刺激前者则会引起血管收缩，而刺激后者则可引起血管舒张。
（二）心肌耗氧
心肌氧耗量由多种因素决定，主要决定因素包括心室壁张力、心率、心肌收缩力。
1.心室壁张力
心室壁张力是指向心肌纤维细胞的一种切线力，是心室壁被拉伸所产生的回缩力。该张力与心室收缩压成正比，当收缩压增加时，心室壁张力和心肌耗氧量就增加。另外，心室壁张力也与心室半径成正比，与心室厚度成反比，心室充盈状态时，其心室壁张力与氧耗量增加。与正常心肌厚度的心肌相比，肥厚的心室壁张力每单位组织的耗氧量较小。
2.心率
心率加快时，每分钟心肌收缩频率增加，能量消耗随之增加，耗氧量也因而上升，相反，心率减慢时，耗氧量就会下降。
3.心肌收缩力
一些使心肌收缩力增加的因素如儿茶酚胺等正性肌力药物，都可直接增加心肌收缩力，增加心肌耗氧量。
二、缺血性心肌病的病理生理学
研究表明，造成心肌缺血的主要原因在于动脉粥样硬化斑块所致的血管狭窄与内皮细胞功能障碍导致的血管张力异常。
（一）血管狭窄
支配心肌的冠状动脉由近端的大血管和位于远端的阻力血管构成，研究表明，位于近端的大血管容易发生动脉粥样硬化，使血管变狭窄，而远端血管不易产生限制血流的斑块，并且可以调整血管的紧张度以适应机体需求。这些位于远端的阻力血管可作为一个血液储备库，机体运动量较大时，其血管内径增加进而供血供氧增加。冠状动脉的狭窄程度和远端阻力血管的代偿扩张能力决定着冠状动脉狭窄的血流动力学。如果狭窄程度小于管腔的70%时，血供可通过血流的加速以及储备和阻力血管的扩张来代偿，若狭窄程度大于70%时，休息时血液的供应尚够，而当运动量增加等一些因素所致的耗氧量增加时，冠状动脉血流储备会显得不足，供氧量将不足以满足耗氧量，将发生心肌缺血。当狭窄程度达到90%时，即使在静息状态下冠状动脉血流量仍不足，心肌缺血可随时发生。
（二）血管张力异常
除了上述血管狭窄以外，内皮细胞功能障碍是另一个引起心肌缺血的重要因素，主要由冠状动脉不适时收缩和抗血栓形成特性的丧失所致。正常情况下血管的收缩/舒张由扩血管物质（如NO）及缩血管物质（如α-肾上腺素）所控制，因两者分泌量的不同而产生不同的血管效应。生理情况下，NO等舒血管物质的血管扩张作用超过儿茶酚胺等缩血管物质的血管收缩作用，因此血管扩张。而当内皮细胞功能障碍时，内皮细胞的扩血管物质分泌减少，儿茶酚胺等缩血管物质的作用相对占优势，出现缩血管效应。研究表明，具有冠心病相关危险因素的患者，在动脉粥样硬化斑块形成之前，即可出现与内皮细胞相关的血管舒张功能受损。在动脉粥样硬化过程中，血管收缩可造成严重的临床病理及症状的出现，如冠状动脉粥样硬化斑块破裂或侵袭，继发完全性或不完全闭塞性血栓形成的一组临床综合征，称为急性冠状动脉综合征。正常情况下，血凝块形成中血小板集聚所产生的产物，如5-羟色胺，可促进内皮细胞释放NO，从而引起血管的舒张。然而，当内皮细胞功能障碍时，血小板产物的直接缩血管作用占主导位置，使血管收缩，加重病情的发展。
另外，其他情况也可引起心肌缺血，包括由于血容量不足或休克时低血压引起的灌注压减少、贫血及缺氧所致的血液携氧能力的下降等，都是非冠状动脉粥样硬化心脏病所引起的心肌缺血，在临床上也是比较常见的。
三、心肌细胞凋亡途径
通常认为心肌细胞是不可再生的终末分化细胞，若发生心肌细胞的坏死或凋亡，心肌细胞的自律性、兴奋性及传导性将会受到抑制，最终会影响心脏的生理功能，导致心脏的泵血功能丧失。研究表明，半胱氨酸蛋白酶家族细胞凋亡蛋白酶（caspase）是启动凋亡程序的重要关键蛋白酶，在正常情况下，其处于无活性的沉默状态，凋亡刺激相应的基因启动并转录成凋亡信号，对下游蛋白的分解、激活和合成发挥着重要的作用。细胞凋亡是个复杂的过程，受机体多基因的严格调控，以维持机体的自稳态。在心肌细胞的凋亡过程中，主要有四种蛋白质分子发挥重要作用：caspase、Bcl-2、凋亡抑制蛋白和衔接蛋白。
（一）caspase
caspase属于半胱氨酸蛋白酶，能够对其下游蛋白质天冬氨酸残基上的肽键进行特异性的切割。该酶受到激活后可以引发下游相关蛋白质的裂解，因此在细胞凋亡过程中起着关键性的作用。根据其在凋亡过程中发挥作用的不同，该酶可分为起始凋亡蛋白酶和效应凋亡蛋白酶两类。前者包括caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10，它们以无活性的单链酶原的形式存在于细胞内部，在相关因子的持续作用下，caspase酶原亚基结合部位受到酶的切割，形成二聚体，该二聚体再进一步整合，从而形成caspase的活性位点、具有蛋白酶活性。而效应凋亡蛋白酶包括caspase-3、caspase-6、caspase-7，该蛋白酶通常在受到起始凋亡蛋白酶的切割后才会被完全激活，活化后的效应凋亡蛋白酶可通过对维持细胞结构及生命活动所需的蛋白进行裂解，从而导致细胞结构的破坏及DNA损伤断裂，最终使细胞出现死亡。在其成员中，与心血管疾病中的心肌细胞凋亡关系较为密切的caspase-3属于秀丽隐杆线虫细胞死亡基因3（CED3）蛋白家族，其处于caspase级联反应的下游，是在细胞凋亡的过程中发挥重要作用的蛋白，与染色质的结构变异、蛋白共轭键的解离及细胞核膜蛋白的分解等关系密切。
（二）Bcl-2
细胞线粒体途径的凋亡在复杂的细胞凋亡过程中发挥着重要的作用，在此过程中，细胞色素c首先需要由线粒体释放到胞质中，而在线粒体的膜上形成允许细胞色素c自由通过的通道，即线粒体外膜透化（mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP）。Bcl-2基因是一种癌基因，具有抑制凋亡的作用。研究显示，Bcl-2在MOMP过程中发挥着重要的调控作用。在Bcl-2家族成员中，有一个或多个Bcl-2同源结构域：BH结构域。根据Bcl-2家族各个分子结构和功能的不同，其家族成员可分为3组。第一组成员包括Mcl-1、Bcl-xL、Bcl-2等具有抗细胞凋亡效应的分子，研究显示这些分子通过抑制促凋亡蛋白Bax和Bak对线粒体膜的透化作用来阻滞细胞的凋亡；第二组成员包括Bax和Bak促凋亡的蛋白质分子，它们可促进蛋白质，如细胞色素c穿过线粒体膜进入胞质中，从而激活胞质内的凋亡蛋白酶激活因子1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1），为起始凋亡蛋白酶原提供结合位点，激发后续细胞凋亡的级联反应，最终引起细胞凋亡；第三组成员包括Bid、Bim和Bad等蛋白质分子，这些蛋白通过直接结合并激活Bax或Bak，促进MOMP的进程，同时还可以抑制第一组Bcl-2蛋白的作用，最终促进细胞凋亡的发生。
（三）凋亡抑制蛋白
研究显示，凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）是一类高度保守的内源性抗细胞凋亡因子家族，其能够与caspase或其他参与细胞凋亡过程的蛋白质分子结合，抑制caspase活性并促进其降解，从而对细胞凋亡过程进行有效调控的蛋白质分子家族。Roy和其同事于1995年从脊髓性肌萎缩症的研究中发现神经元性凋亡抑制蛋白（neuronal apoptosis inhibitor protein，NAIP）。除此之外，目前已经发现的IAP成员还包括X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）、c-IAP1、c-IAP2和黑色素细胞凋亡抑制蛋白（melanoma-IAP，ML-IAP/livin）等8个IAP成员。IAP通过BIR结构域与caspase的IBM结构域结合，从而发挥抑制caspase-3、caspase-7、caspase-9的催化活性，阻滞细胞的凋亡进程。另外，受IAP调控的下游蛋白还包括Smac/DIABLO分子氨基端存在着与IAP结合的模块，IAP可以通过BIR相关序列与靶蛋白的IBM相结合，从而抑制这些蛋白的相关催化活性，然而研究显示不同的BIR结构域产生的蛋白抑制效应具有一定的选择性。新近研究还表明，IAP可导致肿瘤坏死因子（TNF）信号途径中的受体相互作用蛋白1（RIP1）发生泛素化，泛素化后的RIP1可通过抑制TNF-TNFR1-TRADD复合物与caspase-8的结合，从而发挥抑制细胞外部凋亡的途径。在IAP对细胞凋亡的调控中，Smac可通过与IAP相互作用影响IAP对细胞凋亡的抑制作用。
（四）衔接蛋白
衔接蛋白（adapter protein，AP），以胞膜结合蛋白和胞质蛋白两种形式参与相关信号转导过程中蛋白质之间的反应。在凋亡过程中，AP可以作为凋亡刺激因子和caspase之间的信号转导媒介，AP的氨基端其中一段结构与caspase分子结构存在一段同源的结构域。AP可参与细胞线粒体凋亡途径过程中相关蛋白的活动，如Apaf-1、RIP-相关死亡结构域相关蛋白（RIP-associated ICH1/CED3-homologous protein with death domain，RAIDD）、外部凋亡途径的Fas相关死亡结构域蛋白（Fas-associated death domain，FADD）及肿瘤坏死因子受体1相关死亡蛋白（TNFR1-associated death domain，TRADD）等。在细胞受到凋亡刺激因素信号作用下，AP发生蛋白集聚和构象变化，从而为起始凋亡蛋白酶发挥作用提供结合点，从而使caspase发生寡聚化的改变并被激活，最后阶段形成由凋亡刺激因子-AP-活化的起始caspase组成的蛋白复合物，而形成的蛋白复合物具备裂解caspase的活性，诱发下游酶反应，进而出现细胞凋亡。
四、心肌细胞凋亡与缺血-再灌注
研究显示，心肌缺血-再灌注的过程中可造成心肌细胞的凋亡，而心肌细胞凋亡是心肌缺血-再灌注损伤的表现形式之一，心肌细胞凋亡的数目多少决定了缺血-再灌注损伤的严重程度。大鼠离体缺血-再灌注心脏模型证实，若对缺血15min的心肌进行再灌注90min及120min后，检测到心肌细胞凋亡的出现，且随着心肌缺血与心肌再灌注时间的延长而明显增加。出现该现象的原因，可能是在再灌注的过程中，氧自由基的产生明显增多，同时心肌细胞内Ca2+增加，因而推动了缺血心肌细胞发生凋亡。
（一）线粒体与心肌细胞凋亡
1.活性氧及mPTP开放与心肌缺血-再灌注
ROS是需氧细胞在代谢过程中产生的，是许多生化反应的调节剂，研究表明，适度水平的ROS在机体细胞代谢过程中发挥着重要的作用。在氧化应激的状态下，抗氧化是机体清除氧自由基造成损害的主要方式之一。缺血-再灌注发生时，随着冠状动脉血流迅速恢复，氧气供应量也迅速增加，对机体造成一次强的氧化应激损伤过程，线粒体会生成大量的ROS而导致线粒体通透转换孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）的开放。mPTP的大量开放可使线粒体上膜电位丧失，并使细胞内容物如细胞色素c的大量释放，从而激活细胞凋亡的级联程序，最终细胞将进入不可逆的凋亡过程，从而形成恶性循环。
2.线粒体分裂与细胞凋亡
线粒体随着机体环境的变化而出现不同的动态变化，如在应激状态下，线粒体的分裂比率增加。有报道认为，Dpr-1在凋亡早期与促凋亡蛋白Bax结合，负性结构域可抑制线粒体分裂和细胞凋亡。新近研究揭示，线粒体分裂增加在心肌缺血-再灌注损伤过程中起着重要的作用，Dpr-1抑制剂可减少缺血-再灌注损伤。另有研究显示，HL-1在心脏细胞中通过增强与线粒体的融合或通过Dpr-1的负性结构域来抑制线粒体分裂而发挥保护模拟的心肌缺血-再灌注介导的细胞凋亡。因此，维持和保存心肌细胞线粒体功能在干预心肌梗死后心肌细胞死亡过程中具有重要的临床意义，也是心肌梗死治疗的新思路。
（二）离子通道与心肌细胞凋亡
1.钙超载与心肌细胞凋亡
在一些有害因素的作用下，Ca2+在细胞内分布紊乱，导致细胞内Ca2+浓度升高，即为钙超载。研究显示，钙超载是心肌缺血-再灌注条件下心肌细胞发生凋亡的主要原因之一。缺血心肌再灌注后，血供恢复，心肌细胞内Ca2+含量显著提高，可引起细胞膜的损伤，细胞膜通透性会明显增加，进而引起Ca2+的内流，导致钙超载。钙超载发生后可进一步激活Ca2+依赖性的蛋白酶，并催化黄嘌呤脱氧酶转化成为黄嘌呤氧化酶，而氧化应激条件可促进黄嘌呤分解成为尿酸，并形成大量的ROS。因此，钙超载和ROS在心肌缺血-再灌注损伤过程中互为因果关系，共同造成心肌细胞凋亡。
2.氯通道与心肌细胞凋亡
氯通道是机体内含量最多、最具有生理意义的氯离子的主要转运通道。氯通道存在于心脏各类细胞膜上，在维系心肌细胞功能方面发挥着重要的作用。然而，在凋亡发生的过程中，细胞内增加的氯电流可促使细胞形态及细胞稳定性变差，造成代谢物质生成紊乱，线粒体上的电子链完整性缺失，最终细胞发生皱缩，凋亡加速。Okada及其同事进行的电生理实验研究显示，在细胞体积变小时，膜片钳可检测到外向性氯电流，而阻断氯通道可使内质网中的应激蛋白及细胞凋亡明显减少。另一项研究也证实，通过经典的线粒体诱导剂的方法开展的细胞凋亡实验中，检测氯电流明显上升，并出现caspase-3蛋白酶活化的增加，从而验证了氯通道变化在凋亡发生过程中的重要角色。因此，在临床工作中，应用氯电流抑制剂能有效抑制细胞凋亡的发生，维持细胞正常功能。
3.铁超载与心肌细胞凋亡
铁超载又称铁负荷，是在病理条件下或遗传因素作用下，铁过多的摄入，导致机体出现一系列的病理变化。铁离子在机体器官组织中广泛存在，其可参与到电子氧化还原反应过程中，所以当过多铁离子集聚在机体时，可引起氧化应激反应。所以，氧化应激是铁超载的一种病理，在心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心房颤动等许多心血管疾病的发病过程中发挥重要的作用。铁超载发生时，细胞内活性氧的存在不仅可以造成细胞内的氧化损伤，同时还可改变细胞内信号转导途径。研究证实，作为调节细胞因子、生长因子和癌基因Ras激活的细胞生存信号，Akt的激活可对心肌保护起到部分作用，能有效减少心肌细胞凋亡。mTOR是Akt下游的主要信号分子，在分化成熟的血管内皮细胞和心肌细胞中，mTOR可以被蛋白Akt磷酸化而发生激活。体外研究也证实，细胞内ROS介导的Akt/mTOR信号通路的激活可以有效抑制细胞凋亡并促进细胞的增殖，该信号通路的抑制是造成铁超载所致心肌细胞凋亡的重要机制之一。
（三）内质网应激与心肌细胞凋亡
内质网应激是指在缺氧、氧化应激、异常糖基化反应及Ca2+稳态失衡的条件下，内质网未折叠的蛋白会明显增多，超出内质网处理能力时，细胞会激活一些相关信号级联反应。心肌细胞中新生蛋白质的翻译合成后修饰是在内质网中产生的，内质网的高效工作是心肌细胞维持正常功能的重要保障。在心肌缺血缺氧、低氧负荷、Ca2+转运失衡、超负荷刺激时，就会造成内质网应激反应。一旦形成错误折叠蛋白质，内质网腔内肌醇依赖酶1α（inositol-requiring enzyme-1，IRE-1α）就过度激活并发生同源寡聚化。在持续的聚集下，IRE-1α的核糖核酸内切酶可以有效降解含有N端的信号序列，进行mRNA的可变剪切修饰，可最终耗尽内质网中的蛋白质折叠组件。研究表明，过表达的Bcl-2或者Bax/Bak的缺失在内质网应激中起到细胞保护作用，持续不断的内质网应激可以有效激活caspase-12前体，使其裂解成有活性的caspase-12。内质网发生应激时，未折叠蛋白反应三个效应激酶都通过不同方式抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路，蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）是通过磷酸化eLF2a来抑制IκBa的表达，调低NF-κB的活化阈值；而IRE-1激活后可导致肿瘤坏死因子受体相关因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factor-2，TRAF-2）激活NF-KB激酶抑制剂（IKK），进而激活NF-κB信号通路。NF-κB激活后可通过转录上调内质网相关蛋白的表达，从而参与内质网应激的缓解调节。