第十三章　反义显像

20世纪70年代，约翰·霍普金斯医学院和哈佛医学院首先研究发现反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASON）能够阻断特异基因的表达。从此，出现了一门全新的基因工程技术-反义技术。它根据碱基配对原则，利用ASON与细胞内的基因或mRNA特异结合，封闭基因的转录或mRNA的翻译，达到调节基因表达的目的。近年来，反义技术发展很快，已人工合成不同化学修饰的ASON作为核酸药物，用于肿瘤、病毒感染、炎症性疾病、遗传性疾病和高血压等的治疗研究。将放射性核素标记人工合成的ASON，引入体内后通过碱基互补配对原则，与细胞内靶基因或mRNA特异性结合，利用显像仪器显示目的基因或基因过度表达的组织，形成了一种新的诊断方法-放射性核素反义显像。

显像技术的进步在反义显像的发展过程中起重要作用。在众多影像技术中，核素显像由于其高敏感性、高选择性和可行性被认为是最优选的技术。放射性核素的多样选择和放射性标记的反义寡核苷酸化学结合的多样性是核素反义显像的另一重要优势。而且，随着SPECT/CT和PET/CT的应用，使反义显像在显示基因表达的同时，获得高分辨率的解剖信息。近年来临床前小动物显像技术（如micro-SPECT和micro-PET）的应用，也有助于反义显像向临床转化的推进。本章主要介绍核素反义显像的原理、核素标记反义探针的设计、反义显像的现状、面临的主要问题以及发展前景。

第一节　反义靶向与核素反义显像原理

1954年，Watson-Crick和Hoogsteen提出了DNA的双螺旋结构模型和碱基互补原理。他们指出，DNA通常是双股的，并以糖-磷酸酯骨架反平行走向。碱基按照腺嘌呤与胸腺嘧啶、鸟嘌呤与胞嘧啶的方式配对。这一核酸配对模型的提出对生物医学的发展产生了跨时代的重要意义，其中一个创新理念就是于1967年Belikova提出的反义治疗，即应用较短的寡核苷酸序列能与引发疾病基因的某些基因的DNA或mRNA序列特异性结合，从而使其得到抑制。

寡核苷酸（oligonucleotides，SON）是一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称，它是核酸（DNA或RNA）的基本组成部件，分子量为4 000～10 000D。ASON是未修饰或经化学修饰过的单股低聚物，他们设计为包含有与靶向核酸互补的序列。反义靶向的思想基于核酸的特异性互补配对，通过ASON与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与对相关基因表达的调控。其作用方式可能有：

（1）反义DNA与mRNA结合形成互补双链阻断核糖核蛋白体同mRNA的结合，从而抑制了mRNA翻译成蛋白质的过程。

（2）反义DNA能与靶细胞形成一种三链核酸，它通过作用于控制基因转录的转录子、增强子和启动子区，对基因的转录进行调控。

（3）反义核酸与mRNA的结合可阻挡mRNA向细胞质的运输。

（4）反义核酸与mRNA结合后使得mRNA更加易被核酸酶识别而降解，从而大大缩短mRNA的半衰期。

上述四种作用途径都可表现为对基因表达的抑制或调节，且这种调节是特异的。

根据反义靶向的机制，将放射性核素标记在ASON上并作为示踪剂引入人体，通过碱基互补配对原则在体内与目的基因特异性结合，通过合适的核素显像设备，即可以在整体水平实现对病变组织进行基因表达的实时动态监测（图13-1）。反义显像显示生物体内分子水平的变化，而许多疾病发生首先环节就是基因的改变，因此，反义显像能够达到更早期、更准确诊断疾病的目的。

第二节　核素反义显像分子探针

自1994年Dewanjee等在荷瘤小鼠上首次进行完整意义上的核素反义显像以来，经过多年的努力，反义显像已经有了长足的进展。成功的核素反义显像及探针的设计需要考虑以下一些要素：①制备能与目标基因发生特异性结合的反义寡核苷酸片段；②选择适宜显像的放射性核素及简便有效的标记方法；③反义显像需要ASON的稳定传输，要能抵挡酶（如核酸酶）的降解，还要在循环中保持对基质蛋白较低的结合率；④放射性标记的反义探针需要逃避机体免疫系统，在感兴趣细胞中定位，并与靶向mRNA杂交；⑤反义显像探针必须能在靶向位置停留较长时间，同时又能在非靶向器官和组织中快速清除，从而能在SPECT或PET显像中获得良好的对比度。尽管在显像探针上进行了广泛的探索，一些体外结果也显示出积极的意义，但是实现体内显像仍面临很多挑战。

一、反义寡核苷酸的选择及设计

核素反义显像是以碱基互补配对原则与目的基因特异性结合。从理论上讲，只要靶组织中存在某种DNA或mRNA的过度表达，便可人工合成相应的寡核苷酸，制成核素标记的分子探针。但是，实际上，选择合理的反义序列是一件耗时、耗资的工作。因为反义DNA对双链区域的亲和力较单链而言要弱得多，而为了增加稳定性和被翻译调节蛋白识别，mRNA会在许多区域形成链内碱基对，形成诸如发卡、圆环、角形等复杂的二级结构，从而使反义机制更难发挥作用。反义序列通常都是针对mRNA中的单键区域来选择，如启动子及其邻近序列、5′端或3′端非翻译区域等，以减少二级结构的干扰。即便如此，这种选择也不一定合适，因为蛋白质很可能结合这些区域以增加其稳定性，从而妨碍其与反义DNA的结合。ASON的设计还需要注意以下几个方面：①应该避免含4个或4个以上的连续鸟嘌呤碱基，因为他们可通过Hoog-steen碱基配对形成G-四聚体，导致非反义效应。为了克服此问题，可对鸟苷酸进行修饰；②在设计体内实验时，应避免含鸟嘌呤核苷酸（Cytosine-phospho-guanine，CpG）序列的ASON，因为碱基序列大多遵循5′端为2个嘌呤、3′端为2个嘧啶的原则，而CpG序列可激活多种免疫活性，引起非反义效应；③避免与靶基因外的mRNA杂交，可在网上进行BLAST匹配；④设计严格对照的ASON，常采用随机序列对照（与ASON碱基组成相同、但随机排列）、正义对照、颠倒序列对照、错配对照（与ASON在个别点上碱基不同）等。

此外，反义抑制作用的特异性还取决于ASON的长度。这是由于ASON的长度直接影响到与靶基因结合的特异性、可接近性和稳定性、能否被内核酸酶识别、以及对细胞膜的渗透性等。ASON长度过短必将影响其结合的特异性，过长则易扭曲或形成二级结构，影响其与靶mRNA的结合。另外，ASON的长短还与反义探针制备成本高低呈正相关。众所周知，细胞中每条核苷酸均含有4种不同的碱基，单倍体人基因组约含3 × 10⁹个碱基。从统计学计算，17～18个碱基序列长度将有一次出现的机会，并能较好地接近基因靶位，故当ASON的长度少于15个碱基对时则不显示反义活性。因而，设计ASON时一般控制长度为15～20个碱基对。

二、反义寡核苷酸的修饰

作为显像用途的反义寡核苷酸，除了序列特异性外，动物体内的稳定性也是其基本的要求。天然型反义寡核苷酸在体内及体外对核酸外切酶和核酸内切酶活性的降解极为敏感，一旦反义寡核苷酸被注射到动物体内，机体中的RNA酶就会使反义RNA的有效量迅速减少，同时剩下的没有被降解的反义RNA也无法集中到病灶处，而是分散到动物全身。为了增加反义寡核苷酸的体内稳定性，人们对反义寡核苷酸骨架进行了多种化学修饰。

针对核酸的结构，修饰工作可从其骨架、核糖和碱基入手，也可在核酸片段的末端进行偶联修饰。由于核酸酶的作用位点主要是核苷酸中的磷酸二酯键，因此主要对核苷酸的骨架进行修饰。包括对P-O键的修饰、C取代P、S取代P、将含N衍生物引入核苷酸骨架等。其中，以甲基化和硫代化的研究比较成熟。甲基化即用甲基（CH₃-P）取代羟基，硫代化即用P-S键代替P-O键。

硫代寡核苷酸（phosphorothioate oligonucleotides）是比较成熟、应用最广泛的寡核苷酸。该结构中磷酸二酯键未结合的氧原子被硫原子取代，可以提高对核酸酶的抗性。研究表明天然结构的寡核苷酸在小鼠血清中8小时即有微弱降解，24～48小时内基本完全降解，而硫代寡核苷酸24小时内基本未降解，48小时后仅有微弱降解。体内注射天然结构寡核苷酸的血浆半衰期为几分钟，而硫代寡核苷酸为30分钟至1小时。与天然结构寡核苷酸相比，硫代寡核苷酸与DNA或mRNA的亲和力略有下降，但仍能有效干扰mRNA的加工和翻译。硫代寡核苷酸多分布于高血流灌注的器官，在肾、肝、骨髓、脾中浓度高于其他组织，主要从尿中排出，少量经肠道排出。硫代寡核苷酸带大量的负电荷或是因为硫原子的亲脂性，使它可与血浆蛋白和细胞表面受体结合，导致非特异效应与免疫反应等副作用，在反义显像中导致靶与非靶比值下降，降低图像病灶与正常组织对比度，影响图像质量。

混合骨架寡核苷酸（mixed-backbone oligonucleotides）是继硫代寡核苷酸后的第二代寡核苷酸。它在不同的位置上包含不同的修饰，通常由天然DNA、含硫代磷酸酯的DNA、2′-O-甲基RNA和2′-O-烯丙基RNA中的两种或两种以上组合而成。2′-O-甲基RNA在混合骨架寡核苷酸中的位置与它的性质密切相关，将它置于3′或5′端的修饰稳定性显著优于硫代寡核苷酸。混合骨架寡核苷酸减少了硫代磷酸二酯的数量，降低了由硫代引起的副效应，2′-O-甲基RNA/mRNA的双链亲和力增强，保留的硫代磷酸二酯键仍起到了抗核酸酶的作用。混合骨架寡核苷酸在大鼠血浆中保持至少6小时，体内组织分布及清除与硫代寡核苷酸相似，静脉给药后平均清除时间较长。

肽核酸（peptide nucleic acids，PNA）是第三代反义寡核苷酸。大部分寡核苷酸的修饰只在磷酸二酯键或糖环上进行，这是因为考虑到较大范围的修饰会影响杂交特性。PNA用N-（2-氨基乙基）甘氨酸骨架代替整个糖-磷酸骨架，并保留了与DNA、RNA及肽核酸之间形成Watson-Crick配对的特性。PNA生物学性质稳定，不被普通的蛋白酶、肽酶和核酸酶降解，并可与DNA、RNA或肽核酸杂交形成非常稳定的复合体，具有更强的亲和力和更好的特异性。肽核酸可大量人工合成。但肽核酸水溶性差，不易穿过细胞膜，是肽核酸应用的主要障碍。如果能够通过受体介导等方式解决转运问题，它将成为反义显像领域很有前景的修饰结构。有关PNA体内应用与显像的研究已有报道。

鉴于PNA水溶性差的特性，近期又研制另外一种ASON，被称为锁核酸（locked nucleic acid，LNA），它是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O及4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O及4′-C通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，不但降低了核糖结构的柔韧性，还增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。LNA有很多优点：①LNA与DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性；②具有抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性；③水溶性好，能自由穿入细胞膜，易被机体吸收；④体内无毒性作用；⑤具有高效的自动寡聚化作用，合成方法相对简单。

总之，在寡核苷酸中加入磷酸基、糖基或嘌呤、嘧啶修饰可显著增强其抵抗核酸酶的能力，但与此同时，探针的穿膜能力和与靶序列的亲和力也受到了影响。目前为止，在为数众多的修饰结构中，没有一种结构是非常完美的，每种都有其自身的优缺点。

三、放射性核素标记

单链和双链的DNA、RNA以及反义寡核苷酸可标记上多种放射性核素用于体外评估。在早期的反义杂交技术中，大部分放射性标记是将³H、¹⁴C和³⁵S标记的核苷酸掺入到DNA或RNA分子上。尽管发射β射线的³²P或³⁵P已被用于体外杂交试验，但是这些并不适用于在体显像。

以SPECT或PET在体显像为目的时，放射性核素标记SON或ASON的策略是十分有限的，因为寡核苷酸上只有C、H、O、N和P作为其主体元素。寡核苷酸主体中没有金属原子，不能直接被发射γ射线的核素所取代，造成SPECT显像剂制备困难。以正电子发射核素标记时，¹¹C、¹⁵O和¹³N半衰期很短，难以在所需的时间内进行成功的标记和显像。由于这些既已存在的特性，需要将ASON在3′或5′端进行化学修饰以适用于放射性标记，从而达到高产量、高比活度和高稳定的特性。选择合适的放射性核素和适宜的标记方法是反义显像必须考虑的一个重要问题。

（一）用于SPECT反义显像探针的标记

用于SPECT反义显像探针的核素一个重要条件是γ射线的能量和半衰期应适合进行放射性标记和显像。¹¹¹In、^99mTc和¹²³I都是合适的放射性核素，也均已经用于反义探针的标记和反义显像。相比之下，^99mTc由于具有理想的物理半衰期（约6小时），适于显像的γ能峰（140keV），以及容易获取、价廉易得等优点，而被广泛应用于显像研究中。

1.^99mTc标记

^99mTc标记ASON常用间接标记法。间接标记法是通过双功能螯合剂将放射性核素与标记物偶联起来。双功能螯合剂犹如一座桥梁，一端连接要标记的目标化合物，另一端络合放射性核素，在普通的条件下即可完成标记。通过双功能螯合剂的应用，不改变标记物的特性，键合牢固，并且可以避免对标记物的损伤，达到核素显像的要求。双功能螯合物有环状复合结构，可有一个放射性金属离子与多齿配体螯合，因而生成的放射性核素螯合物可以与反义寡核苷酸稳定结合。目前有几个^99mTc螯合物可以与反义寡核苷酸结合用于标记。包括二乙三胺五乙酸（DTPA）、巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基丁二酰亚胺酯（NHS-MAG3）和肼基尼古酰胺（HYNIC）。DTPA及其衍生物用于对蛋白质（如抗体）的¹¹¹In及其他几种核素的标记时效果很好，但用于^99mTc时则标记物不稳定。在标记寡核苷酸上已不常用，现在常用的是HYNIC和NHS-MAG3。

Hnatowich等的课题组开发了^99mTc标记ASON的螯合物HYNIC，经过偶联螯合后，标记率约为60%。同一小组通过修饰的MAG3螯合物成功地将^99mTc标记PNA，且标记率达到70%，比活度可高达0.4Ci/μmol。Hnatowich用三种不同螯合物（DTPA、HYNIC和MAG3）用于ASON的^99mTc标记。三种方法的标记率不同，最高的是 HYNIC-ASON（60% ± 7.5%），其次为 MAG3-ASON（40% ± 5%），而DTPA-ASON的标记率小于10%。HYNIC和MAG3-ASON的比活度都高达2.3Ci/μmol，而 DTPA-ASON 则小于 0.14Ci/μmol。Hjelstuen等用MAG3-TFTP酯形成与ASON 3′己胺的结合，从而有助于^99mTc标记，此复合物比活度约2.8Ci/μmol，放化纯高于97%。Liu M等在近期的研究中将靶向hTERT mRNA的ASON用双功能螯合剂S-acetyl NHS-MAG3偶联后标记^99mTc，室温下反应15～30分钟，标记率可＞ 70%，比活度达0.25Ci/μmol，纯化后放化纯＞ 96%。这些研究都意味着在反义显像的^99mTc标记过程中螯合物及其修饰的重要性。

2.¹¹¹In标记

¹¹¹In也是反义寡核苷酸探针开发的重要核素，因为其具有较长的物理半衰期（2.8天），有助于研究ASON在体内的生物分布和转归。¹¹¹In以电子俘获方式衰变并放射171keV和245keV的光子，可用于SPECT显像。

Dewanjee等对¹¹¹In标记的寡核苷酸做了详细研究，他们首选合成了与c-myc mRNA互补的15-mer ASON序列并连接了氨基，从而形成AHON，然后应用DTPA偶联，将¹¹¹InCl₃与DTPA-AHON一起孵育30分钟后，得到产率为45%～60%。Lewis M等用¹¹¹In标记PNA，他们用DOTA的一种新的衍生物Fmoc-K（DOTA）与PNA偶联，证实这种螯合物能与PNA共轭的任何序列位点结合，标记探针放化纯接近100%，比活度大于1Ci/μmol，这比Dewanjee MK等早先所报道的高很多，结论是对于¹¹¹In标记来说Fmoc-K（DOTA）比DTPA更好。然而，在另一研究中He Y等开发了将¹¹¹In与PNA标记的方法，为便于DTPA偶联，他们将PNA加上赖氨酸标签，HPLC纯化后大约80%的PNA-DTPA标上了¹¹¹In。需指出的是DTPA偶联ASON的标记简便，而且不需要随后的纯化。

3.放射性碘标记

放射性碘也被用于SPECT反义显像。¹²⁵I物理半衰期约60天，发射γ射线，最大能量为35keV；¹²³I具有相对短的半衰期（13.22小时），衰变的主要γ射线能量为159keV和27keV。两者均已用于ASON标记及显像。

Dewanjee M等优化了碘标记的条件，他们将ASON的5′末端用氨基己基团修饰，并用PMPITC与之结合，从而利于¹²⁵I标记。随着孵育时间的延长，标记率随之提升，产量可达50%～60%。而且，这种标记方法得到的比活度（80mCi/μmol）是应用碘直接标记法得到比活度（8mCi/μmol）的10倍。Dougan H等成功地用¹²³I标记了经锡烷基修饰的ASON，标记产量97%，比活度达15Ci/μmol。在另一项研究中，Kuhnast B等开发了卤素标记反义寡核苷酸用于显像研究的一个更广泛和多功能的方法。这个方法基于硫代磷酸酯寡核苷酸的3′末端与卤素苯乙酰胺化合物偶联。这一偶联方法成功应用于不同长度寡核苷酸的标记和包括¹²⁵I在内的多种放射性卤素。

（二）用于PET反义显像探针的标记

相对于SPECT来讲，PET拥有更高的敏感性和空间分辨率，而且正电子发射核素可代替天然存在的原子，对放射性标记分子的行为改变更少。但是如前所说，PET核素半衰期短，要求更快的化学反应并进行随后的PET显像，而作为反义显像分子探针，这又限制了其应用。采用快速标记和显像克服或至少部分克服了这一限制，正电子反义显像的应用仍然有可行性。

1.¹⁸F标记反义探针

¹⁸F是反义显像中有前景的正电子核素，因为它有适度的半衰期（110分钟）。上述¹²⁵I标记寡核苷酸的方法，最初由Kuhnast B等应用于¹⁸F标记ASON。他们用N-（4-［¹⁸F］-氟代）-2-溴乙酰胺的前体标记硫代磷酸酯寡核苷酸的3′端，用于¹⁸F探针的制备。类似的方法还包括应用 4-（［¹⁸F］-氟代）苯甲酸苯酯或 4-（［¹⁸F］-氟代）异硫氰酸苯酯标记5′己胺修饰的寡核苷酸。Pan D等报道了用5′-去氧-5′-［¹⁸F］-氟-O₄-甲基胸苷修饰寡核苷酸的5′结合处，从而得到放射性探针。这个方法的优势是整个反应和后处理可在4小时内完成，这是应用¹⁸F等短半衰期核素的必要标准。Tavitian B团队研发了PNA的¹⁸F标记的可靠方法，比活度高达1Ci/mmol。

2.¹¹C标记反义探针

¹¹C并不常用于反义寡核苷酸显像，主要是因为20分钟的短半衰期给化学合成、纯化和显像带来时间上的限制。但是一些研究者开发了新型策略来克服时间上的限制。Kobori N等利用相比-NH和-OH来说¹¹C-乙基酮更易攻击-NH₂基团的特点，将硫代磷酸酯寡核苷酸的5′己胺衍生物标记上¹¹C-乙基酮，比活度达到5Ci/μmol，得以实时观察mRNA表达。在另一项研究中，Visser G等成功地用¹¹C-胸苷标记寡核苷酸。这些均表明¹¹C作为反义显像的PET核素是可行的。

3.⁶⁸Ge/⁶⁸Ga标记反义探针

⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器的设计和其商业化的最新进展使研究者恢复了对⁶⁸Ga标记PET显像剂的兴趣。⁶⁸Ga是¹⁸F有价值的替代核素，因为它不需要回旋加速器，使用更为方便。Roivaienen A等用应用大环螯合剂DOTA偶联ASON后进行⁶⁸GaCl₃标记，标记反应在100℃下10min内完成，30分钟时的放化纯约99%，比活度约68mCi/μmol，标记探针室温下4小时以上仍可保持稳定。随后一些研究也应用同样的螯合剂DOTA进行了成功的标记。

第三节　核素反义显像现状

自反义显像概念提出后，国内外学者进行了一系列肿瘤反义显像研究。Dewanjee MK在1994年首次进行完整意义上的反义显像研究。他们以DTPA为螯合剂，用¹¹¹In标记与c-myc mRNA序列互补的15聚体硫代寡核苷酸为实验组，以正义寡核苷酸作对照研究。结果表明，肿瘤细胞对ASON的摄取是对照组的10倍，摄取快、靶/非靶比值高。在体显像时，注射后标记探针后0.5小时，8%～10%的硫代寡核苷酸聚集在瘤体内，而对照组不到1%。标记探针肿瘤/血和肿瘤/肌肉比值分别高达 3.55 ± 0.23 和 24.48 ± 3.27。这样理想的结果至今没有被重复获得。

在此基础上，随着分子生物学的发展及反义显像技术的改进，越来越多的学者投入到反义显像研究中。1996年，Cammilleri S等通过在荷人NS2T2A1乳腺癌瘤体内注射¹²⁵I标记的与TGF mRNA互补的ASON，显像发现注射标记物后1小时有15%注射容量（ID）在瘤体内，但是90%的放射活性在4小时内从肿瘤部位转移至肠道和肾脏，24小时瘤体内仅残留1%。虽然得到显像，但是这次试验没有设置阴性对照组。Kobayashi H的研究团队通过腹腔内注射¹¹¹In标记的c-erbB-2 ASON与胺树枝状聚合物或与生物素偶联，在24小时能够清晰显示接种至裸鼠腹腔内的人SHIN3卵巢肿瘤，但这项研究同样没有设置阴性对照。Hantowich DJ团队长期致力于反义显像，他们的其中一项肽核酸（PNA）显像的研究显示，^99mTc-PNA体内稳定性更高，代谢动力学更适合于体内显像。在小鼠左侧腿部肌肉注射含靶PNA的聚苯乙烯磁珠，右侧腿部注射不含PNA的磁珠作对照。尾静脉注射^99mTc-PNA后2.5小时和24小时体内分布研究结果显示，PNA在体内清除非常快，半衰期约2小时，注射后2.5小时，肾的最大摄取只有1.5%ID/g，24小时所有取样组织的总放射性不到0.07%ID/g。经腹膜注射^99mTc-PNA，23小时全身显像只有肾、膀胱显影，左侧腿部模型组织/右腿部放射性比值达6∶1。通过这一实验巧妙地证实反义杂交理论在体内仍是可行的。

国内也开展了一系列肿瘤反义显像研究。谢娟等应用^99mTc标记c-erbB2 ASON并与表皮生长因子连接，进行裸鼠乳腺癌显像。结果显示瘤体部位摄取核素明显高于对照组，该反义探针是利用表皮生长因子的配体/受体的特异性识别作用，增加反义寡核苷酸的靶向型和特异性，使反义探针更多地分布到肿瘤组织中，以实现对c-erbB2基因高表达的乳腺肿瘤的显像。高再荣等应用NHS-MAG3作为螯合剂标记survivin反义寡核苷酸进行肝细胞癌显像也获得了成功。研究显示注射显像剂^99mTc-MAG3-survivin ASON后0.5小时肿瘤组织已开始显影，显像剂在肿瘤组织内的聚集程度随时间延长而逐渐增加，于4小时达到最大，肿瘤/对侧肢体肌肉比值分别为2.48 ± 0.44（体外显像）和3.35 ± 0.57（生物学分布）（图13-2）。王荣福等报道用DNA合成仪将酪胺连接在免疫球蛋白重链V1家族框架（IgHV1FR）mRNA反义寡核苷酸（FR-ASON）的5′端，氯胺-T法进行¹²⁵I标记，标记率为80.7%，放化纯度为98.7%。标记的FR-ASON对淋巴瘤具有更好的识别特异性，体外稳定性好，为下一步淋巴瘤反义显像或反义治疗奠定了实验基础。付鹏等应用^99mTc标记p53基因的最直接调节基因MDM2 mRNA的反义寡核苷酸及错义寡核苷酸，荷乳腺癌裸鼠SPECT显像结果示，脂质体包裹的反义探针1小时即能在肿瘤病灶内清晰显示，随时间延长，肿瘤/骨骼肌放射性比值逐渐增加，病灶显示更清晰。增殖细胞核抗原（PCNA）是一种细胞增殖性基因，能促进细胞的增殖分化。张艳荣等应用NHS-MAG3作为螯合剂标记PCNA反义寡核苷酸在卵巢癌细胞中发现，反义探针能被增殖旺盛的肿瘤细胞选择性摄取，并能抑制细胞增殖以及显著抑制PCNA mRNA的表达，说明反义寡核苷酸在标记后能特异性结合于目的基因序列并能产生反义作用，这项研究证实了反义显像的理论依据。

除将反义显像应用于肿瘤早期诊断外，张永学课题组还观察到PCNA反义探针能特异性地聚集于增殖旺盛的血管平滑肌细胞中，这一体外实验为进一步将反义探针应用于动脉粥样硬化斑块的显像诊断奠定了充分的研究基础。他们先后应用^99mTc标记c-myc ASON及PCNA ASON证实在动脉粥样硬化斑块中的显影（图13-3），从而为易损动脉粥样硬化斑块的早期无创诊断开创了一种新的方法。这些研究说明反义显像不只局限于肿瘤诊断方面，在其他疾病的诊断中仍有广阔的空间。

第四节　核素反义显像存在的主要问题

随着核素标记技术的多样化以及分子生物学技术的进步，反义显像的概念已在体外细胞实验中阐明，并初步成功地在体内显像中展现。但是，在体反义显像仍存在诸多困难，包括ASON的体内稳定性、标记探针向靶细胞的传递和转运、与靶向mRNA的特异性结合以及靶向mRNA的浓度影响等，其中最为重要的因素之一是核素标记ASON内化进入细胞后与靶向mRNA杂交能力不足。

一、体内反义寡核苷酸的稳定性

尽管天然的寡核苷酸有较好的杂交潜力，但在体内血浆中稳定性却有变化，半衰期从低聚核糖核酸的数秒，到寡二核苷酸的数分钟。为了解决这一问题，需要在尽可能保留其原始序列与它们同类物质相近的基础上，对寡核苷酸的骨架进行化学修饰。这些修饰方法已经在前面反义寡核苷酸修饰中作了详细介绍，在此不再赘述。可以得出的结论是，这些新型化学修饰方法的应用，对体内ASON的稳定性确实有深入的影响，并会引起ASON体内药代动力学和生物分布的改进。

另外，标记过程中应用双功能螯合剂以及放射性核素的选择都可能会对体内稳定性产生影响。Goodchild J和同事应用³²P标记一种ASON静脉注射到兔子时，其被完全降解，而这一标记探针在体外与新鲜抽取的家兔和人血液孵育时却十分稳定。一些在体外稳定、或者根据化学性质预测体内稳定而进行化学修饰的标记探针，体内稳定性结果可能不尽相同。因此，对于双功能螯合剂的选择及标记的过程中包括pH值、反应时间、温度等可能仍需要更多的实验研究。

二、核素标记ASON的体内靶向特征

到目前为止，研究人员已经通过一系列体外细胞实验及在体显像等各种方法证实反义显像发生的机制是反义技术。但是需要注意的是，一些在体外得到阳性结果的核素标记ASON探针，在体内并不能得到同样的结果。标记探针在体内的药代动力学和组织生物分布、反义寡合甘酸的骨架、长度及溶解度、ASON与血浆的结合能力、靶组织/细胞中mRNA的浓度等都是影响核素标记ASON体内靶向性的重要因素。

标记探针在体内的药代动力学和组织生物分布是靶向功能的重要影响因素之一。由于ASON体内稳定性差，就需要更为严格的药代动力学参数以满足反义靶向作用的需要。评估标记反义探针在生物体内的药代动力学时，必须要考虑这一探针在所有组织器官中的稳定性、特异性/靶向能力、细胞内化功能以及溶解特性等。另外，标记探针衍生物在体内的清除也很重要。有研究表明，磷酸二酯ASON在几分钟之内从血液中快速清除，其主要的放射性聚集在肾脏和肝脏。硫代ASON具有双向血浆清除率，在1小时内的短期清除，随后是长达1～2天的二次清除。PNA衍生物在血浆循环稳定性好，经肾脏快速清除。此外，ASON的长度也与其在体内的生物分布密切相关。

为了更好地了解各种不同核素标记反义探针的特性，Tavitian B等在猴子体内应用3′-末端-¹⁸F标记的寡核苷酸，研究重点是评估磷酸二酯、硫代和2′-O甲基RNA类似物之间的差异。他们的数据证实反义寡核苷酸的靶向杂交能力与放射性核素标记的方法无关，但ASON的骨架改变确实引起药代动力学和组织分布的改变。

反义寡核苷酸的溶解度影响核素反义探针在细胞间的运输。通常，因为放射性标记的寡核苷酸脂溶性差，他们无法有效地穿过细胞膜。而且，茎环或发夹结构的RNA形成复杂三维结构，这些结构会明显限制体内ASON与互补链的杂交。在Stein C报告中指出，只有6%～12%靶向的RNA序列可以达到“反义效应”。

一些ASON（如硫代ASON）可以与血浆蛋白结合，对标记探针的靶向作用产生明显的影响。研究发现，光活化磷酸二酯ASON与细胞培养时，90% ASON与高分子量（75～79kD）的细胞膜蛋白结合。de Vries等人证实，¹⁸F标记诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的ASON在细胞中有较高的非特异性结合，从而阻碍其与iNOS mRNA特异性靶向杂交而影响显像。

靶组织/细胞中mRNA的浓度不够高，以致难以通过反义杂交成像显示出来，这是很多研究者关注的问题。尽管在感染细胞中病毒-RNA的数量充沛，但一般来说，编码特定蛋白的信使RNA（mRNA）数量往往并不充足。一个典型的哺乳动物细胞只包含皮克水平的RNA，经过计算这差不多相当于每个细胞内有30万～50万个RNA，而其中mRNA只占很小部分，而且根据细胞功能不同mRNA可能多达11 000种。有研究表明，反义显像中靶向mRNA的数量应占细胞内总mRNA含量的3%，而细胞内其他种类的mRNA需小于0.01%。

假设在每个细胞中只有一种靶mRNA，而且只通过特异反义结合原理聚集ASON，在^99mTc标记22个碱基ASON（分子量约6 000D）且比活度约100μCi/μg时，以每克组织中有10⁸个细胞计算，那么每克靶组织中只能聚集10^-6μg或0.000 1μCi核素反义探针。在应用正电子核素标记时，假设比活度在10 000μCi/mmol（2 000μCi/μg）时，每克靶组织中的聚集量约0.002μCi。显然与周围本底相比，靶组织中这样低的核素量是难以获得显像的。因此，反义显像通常用于显示的靶向mRNA是过量表达的，通常在每个细胞中超过100个拷贝。而且，随着标记技术的提高，核素标记ASON的比活度也在不断提高。假设在每个细胞中有100个靶向 mRNA，^99mTc标记的比活度在 100 000μCi/μg，那么每克靶组织中可以浓聚10μCi核素探针。这高于常规肿瘤显像中^99mTc标记抗体而得到的结果，后者每克肿瘤组织中聚集探针最高达到0.01%注射剂量，大约为2μCi/g。以同样的假设，应用正电子核素标记ASON时，在标记探针比活度为2 000μCi/μg 时，在每克靶组织中约有 0.2μCi。尽管这一数值远低于^99mTc标记探针，但是由于PET显像的高敏感性，理论上显像仍可行。当然，由于不同标记探针体内药代动力学的差异以及细胞膜转运的各异，在低拷贝数目时，靶组织不可能聚集足够核素标记探针，计数率也因此下降。但无论怎样，上述数据还是证明了反义显像是可行的。

动力学参数在反义显像的靶向杂交能力评估中也十分重要，这主要是由于显像成功的因素中还包括给药途径、清除速度以及在靶组织中的选择性聚集。Nakamura K等人发现，当静脉注射核素标记ASON于荷KB-G2肿瘤小鼠中时（此肿瘤过度表达MDR1 mRNA），仅有约400个ASON聚集在肿瘤中，而当将标记探针直接注入肿瘤内时，大约有60 000个ASON在肿瘤中聚集。他们认为数量的差异是由于静脉注射和瘤内注射时，标记探针到达靶组织中的数量不同。

三、核素标记ASON的体内转运

合适的转运系统在反义显像中十分重要。无修饰ASON在细胞内的摄取是由于主动转运，然而内化作用在许多细胞中十分缓慢而且呈温度依赖性。也有研究报告显示，无修饰的ASON（如硫代ASON）很大一部分与细胞表面蛋白相互作用，而内化的小部分ASON在进入到溶酶体时就终止内化，这样使得mRNA在细胞质或细胞核内的靶向杂交成为困难。ASON还可以通过吸附作用、内吞和胞饮作用进入细胞，只是进入细胞的比例依赖于ASON的浓度、细胞类型和活性状态。ASON如何更好地定位于靶组织并穿透细胞膜进入细胞是非常重要的。

增加ASON在细胞中转运能力的一个策略是将ASON偶联穿膜肽或转运肽。Pooga M等人应用细胞转运肽与PNA偶联转运至大鼠细胞中，成功地抑制功能性基因的表达。Rosi N等开发了一种金纳米粒子-ASON聚合物，促进细胞内基因的调控。这一纳米粒子聚合物不易被核酸酶降解、对细胞无毒性，而且在多种细胞摄取实验中，显示比未修饰ASON结合力高得多的特性。

目前基因治疗中载体优势潜能已被证实，如使用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒感染、阳离子脂质和脂质体载体等。据推测病毒载体较其余非病毒载体在介导DNA进入细胞时更有优势，但其在显像中的应用可能受到限制。主要原因是DNA不能迅速、有效地与载体偶联，而放射性核素半衰期是有限的。另外病毒存在毒性，如腺病毒对其要整合的DNA有一定免疫源性，逆转录病毒则可能诱导基因突变。在健康人群中使用有潜在毒性的载体也是不能被接受的。

目前在显像中能够应用的载体是阳离子脂类和脂质体。两者均可稳定连接寡聚核苷酸中的阴离子，也可保护核酶，并且简单的混合即可达到成功的连接。目前阳离子脂质体较阳离子脂类更有优势。脂质体是由脂质双分子层组成的环形封闭囊泡，低毒、无免疫原性，可携载各种反义寡核苷酸，保护其不被核酸酶降解。脂质双分子层可以便捷的将脂类与具有阴离子活性的DNA相连接，也可以方便的与阴离子活性的动物细胞包膜相连接，从而提高细胞包膜转运。张永学课题组的系列研究中，应用脂质体包裹^99mTc-Survivin ASON和^99mTc-PCNA ASON后，肿瘤细胞（肝癌细胞和卵巢癌细胞）对标记探针的摄取率明显增加，大大高于未处理组。有研究表明，在脂质体介导下，血液循环中的反义寡核苷酸至少在24小时内保持完整，而单纯反义寡核苷酸5分钟后将不能被检测到。由于反义寡核苷酸与脂质体结合后主要集中在细胞核，而单纯反义寡核苷酸则主要位于细胞质中，因而脂质体改变了其在细胞内的分布，使反义寡核苷酸在细胞核内的作用时间延长。需要注意的是，脂质体自身亦有一定的毒性，当脂质体的浓度高于20μmol/L时具有细胞毒性。

受体介导的反义寡核苷酸的转运技术也越来越受到重视。受体介导的细胞吞噬作用是20世纪70年代发现的细胞转移特异性外源物质进入胞内的一种方式。利用受体介导来特异性转移反义寡核苷酸有助于反义显像。受体介导的吞噬作用有两个明显特点：①具有细胞、组织或器官专一性；②配体进入细胞的转移效率很高。

未来发展方向

尽管应用核素标记ASON分子探针在体外和在体显像中均取得了令人振奋的结果，但是所有的研究还都仅限于细胞及动物实验阶段，将反义显像转化至临床仍有很多工作需要开展。这包括简化ASON探针合成、化学修饰及核素标记过程，增加探针体内稳定性，强化与靶mRNA特异性杂交能力等。在体显像还需满足标记探针克服体内转运过程中的生物屏障、准确的体内靶向定位、体内信号放大、在靶组织中有效的滞留和在非靶组织中迅速清除等条件。几乎所有疾病的产生都是由于基因异常表达或表达产物的功能异常所导致。理论上，反义显像能在基因水平诊断包括肿瘤、遗传性疾病、炎症、病毒感染等很多疾病，这一巨大的应用前景值得对反义显像进行更为深入的研究和探索。

（兰晓莉）

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