3.4 多孔混凝土特定生境微生物分析

3.4.1 微生物生物量的测定

目前，在水生物处理领域应用最广泛的微生物量测定方法是脂磷法，因大部分微生物生物膜脂类是以磷脂（phospholipids）的形式存在的，磷脂在细胞死亡后很快分解，磷脂中的磷（脂磷，Lipid-P）的含量容易通过比色法测定，因此脂磷法测定的微生物量可以用来表征活细菌总数，并有资料表明，脂磷法测得的生物量比传统培养法测得生物量较为准确。

测定步骤为：准确称取5g新鲜泥样，放置于100mL具塞三角瓶中，加入25mL纯水，充分振荡15min，确保无颗粒状土，依次加入氯仿5mL、甲醇10mL、纯水4mL（氯仿、甲醇、纯水的体积比为1∶2∶0.8），用力振荡10min，静置12h后，再向三角瓶中加入氯仿、纯水各5mL，最终使得氯仿、甲醇、纯水的体积比为1∶1∶0.9，用力振荡10min，静置12h，取出含有脂类的下层氯仿相5mL转移至10mL具塞比色管中，水浴蒸干。向比色管中加入5%的过硫酸钾溶液0.8mL，加水至刻度，在高压锅中121℃（1.1～1.4kg/cm²）消解30min。取出冷却至室温，然后向比色管中加入10%抗坏血酸溶液0.2mL，混匀，30s后加入钼酸盐溶液0.4mL，充分混匀，放置15min，以水为参比，700nm波长，10mm玻璃比色皿比色，记录吸光度，根据标准曲线，计算脂磷浓度，再换算成每克泥样中脂磷含量。

标准曲线的绘制方法如下：吸取50μgP/mL KH₂PO₄标准储备液2mL移入50mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，制备浓度为2μgP/mL的标准溶液，分别吸取标准溶液0.00mL、0.05mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL移至10mL比色管中，稀释至刻度，再分别向比色管中加入10%抗坏血酸溶液0.2mL，混匀，30s后加入钼酸盐溶液0.4mL，充分混匀，放置15min，以水为参比，700nm波长，10mm玻璃比色皿比色，记录吸光度，绘制标准曲线。

3.4.2 基质脱氢酶活性的测定

脱氢酶活性的测定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法，测试原理为脱氢酶能酶促脱氢反应。在泥土中，糖类和有机酸的脱氢作用比较活跃，它们均可作氢的供体，TTC受氢后，能生成脂溶性的红色的三苯基甲簪（TPF）。

测试过程如下：准确称取5.0g新鲜泥样，放入100mL具塞三角瓶中，加入25mL纯水，充分振荡15min，制得土壤悬浊液，加1mg/mL TTC溶液（缓冲液配制）5mL，pH值为7.6的0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液2mL，充分振荡10min，确保无颗粒状土粒存在，同时设置对照，对照以pH值为7.6的0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液代替TTC，在37℃下置暗处培养24h。培养结束后，加2滴浓硫酸中止反应，然后加入5mL甲苯，摇床上津提30min，完全提取三苯基甲簪（TPF），稳定数分钟，将培养液移入离心管，于4000r/min下离心5min。取上层有机溶液，用10mm玻璃比色皿于分光光度计485nm波长处比色，根据标准曲线计算TTC浓度。根据浓度换算成每克泥样中TF的含量，即表示基质的脱氢酶活性。

脱氢酶活性标准曲线绘制方法如下：称取50mg烘干的TTC于50mL容量瓶中，稀释至刻度，制得标准溶液，浓度为1mgTTC/mL；量取38.5mL浓度为0.2mol/L的HCl溶液与50mL 0.2mol/L的Tris溶液混合，并移入1000mL容量瓶中，稀释至刻度，可制得pH值为7.6的0.2mol/L Tris-HCl缓冲液。分别吸取TTC标准溶液0.0mL、1mL、2mL、5mL、7mL、10mL于50mL容量瓶中，用纯水稀释至刻度，制取一系列工作液。然后分别往9支干净的50mL具塞比色管中，依次加入0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液2mL、不同浓度的工作液1mL、10%的Na₂S溶液1mL，混匀，放置20min，再向各管分别加入5mL甲苯，置于摇床上浸提30min，完全提取三苯基甲簪（TPF），稳定数分钟，取上层有机溶液用10mm玻璃比色皿于分光光度计485nm波长比色，绘制标准曲线。

3.4.3 基质脲酶活性的测定

测试原理为：以尿素为基质，酶促水解后所生成的氨在强碱性溶液中，与纳氏试剂反应，生成黄色的碘化双汞铵，以检测土壤脲酶活性。

测定步骤为：准确称取5.0g新鲜泥样，置于100mL三角瓶中，加入10mL纯水、10mL磷酸缓冲液（pH值为7.6）及0.5mL甲苯，震荡15min，加入10%的尿素溶液10mL（对照以水代替），置于37℃恒温箱中培养48h。培养结束后，加入20mL1mol/L的KCl溶液，充分摇匀10min，将悬浮液用致密滤纸过滤，然后吸取5mL滤液置于50mL具塞比色管中，稀释至刻度，加入25%的酒石酸钾钠溶液1mL、纳氏试剂0.8mL，显色10min后，以空白为参比，于分光光度计460nm波长比色测定，根据标准曲线计算溶液浓度，再换算为每克泥样中的脲酶含量。

标准曲线的绘制：配制50μg/mL的标准氨工作液，分别取0.0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL于10mL具塞比色管中，用水稀释至刻度，摇匀，加入1mL酒石酸钾钠、0.8mL纳氏试剂，10min后，以空白为参比，于分光光度计460nm波长比色测定，绘制标准曲线。

3.4.4 基质微生物活细菌测数

基质测样的制备：准确称取10g新鲜泥样，迅速倒入盛有三四十粒玻璃球的100mL无菌水的具塞三角瓶中，充分振荡15～30min，制成稀释10倍的样品稀释液，静置30s后，用1mL灭菌吸管吸取1mL10倍稀释液加入9mL无菌水中（勿使吸管碰到无菌水），摇匀，即制成100倍稀释液，按照上述方法可稀释到10³、10⁴、…稀释度分别记为10^-3、10^-4、…。

基质微生物活细菌数的测定采用涂抹平板培养计数法，将冷却至50℃左右的琼脂培养基注入灭菌的培养皿中，待凝固后，放置于28℃的恒温箱中培养36～48h，选取稀释度为10^-6、10^-7、10^-8的样品稀释液，每培养皿接种1.0mL，用无菌涂棒将稀释液均匀涂抹在平板表面。将接种后的培养皿置于37℃恒温箱中，培养2～4d，计算菌落数，换算为被测样品的活细菌数。

3.4.5 氮转化功能菌群分析方法

3.4.5.1 氨化细菌的测定

测定原理：氨化细菌能分解氨基化合物并生成氨，根据在不含无机氮的蛋白胨培养基上的生长状况来估算氨化细菌的数量。本书采用培养基平板计数法测定氨化细菌的数量。

培养基：蛋白胨5g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.25g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄ 0.01g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2。121℃（1.05kg/cm²）灭菌30min。

操作步骤：制备稀释度为10^-6、10^-7、10^-8、10^-9的基质稀释液，每个稀释度接种1mL于培养皿中，加入冷却至50～60℃的培养基12mL，混匀并冷却凝固，28℃培养2～4d，计算菌落数，计算每克新鲜泥样中氨化细菌的数量。

3.4.5.2 硝化细菌-反硝化细菌的测定

测定原理：硝化作用是由铵被亚硝化细菌氧化为亚硝酸盐和进一步被硝化细菌氧化为硝酸盐的过程，反硝化细菌能以硝酸根离子为电子受体，使硝态氮还原为气态氮。根据亚硝化细菌、硝化细菌和反硝化细菌形成的产物，用稀释培养计数法（MPN）估算泥样中相应类群的微生物数量。

仪器：高压灭菌锅、三角瓶、移液管、白瓷比色板、1.8cm×18cm试管、无菌吸管。

试剂：格里斯（Griess）试剂（A液：将0.5g对氨基苯磺酸加到150mL 20%的稀乙酸溶液中；B液：1gα-萘胺加到20mL蒸馏水和150mL20%的稀乙酸中，A、B液均保存在棕色瓶内）、锌碘淀粉试剂（20g ZnCl₂溶于100mL蒸馏水，煮沸，另取4g可溶性淀粉，加少许水、调成浆状，徐徐加入煮沸的氯化锌溶液中，边加边搅拌。将混合液煮沸，直至淀粉完全溶解为止，然后加入干燥的碘化锌2g，并加蒸馏水至1000mL，保存于棕色瓶内）、2.5%二苯胺、胺磺酸、乙酸、浓硫酸、纳氏试剂等。

1.亚硝化细菌

铵盐培养基：（NH₄）₂SO₄ 2.0g、KH₂PO₄ 0.75g、NaH₂PO₄ 0.25g、MgSO₄·4H₂O 0.01g、MnSO₄·7H₂O 0.03g、CaCO₃ 5.0g、蒸馏水1000mL。将培养基分装于1.8cm×18cm试管中，每管5mL。121℃（1.05kg/cm²）灭菌30min。操作步骤如下：

（1）制备稀释度为10^-2、10^-3、…、10^-7、10^-8的基质稀释液，每管培养基中接种稀释液1mL，每一稀释度重复3管，另接1管无菌水作为对照。于28～30℃培养10～14d。

（2）取培养好的培养液2滴，滴在白瓷比色板上，加Griess试剂A液1滴，再加Griess试剂B液1滴，若呈现绛红色，说明产生HNO₂。由此确定数量指标，查MPN表并求出亚硝化细菌近似数，换算为每克泥样中亚硝化细菌的数量。

2.硝化细菌

亚硝酸盐培养基：NaNO₂ 2.0g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、Na₂CO₃ 1.0g、FeSO₄ 0.4g、NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL。将培养基分装于1.8cm×18cm试管中，每管5mL。121℃（1.05kg/cm²）灭菌30min。操作步骤如下：

（1）制备稀释度为10^-2、10^-3、…、10^-7、10^-8的稀基质释液，每管培养基中接种稀释液1mL，每一稀释度重复3管，另接1管无菌水作为对照，于28～30℃培养10～14d。

（2）培养结束后，检查有无的存在，若有，应去除其干扰，方法为，向试管中加5～10滴乙酸，再放入数粒胺磺酸，等氮气释放完毕，再加入1粒胺磺酸。

（3）去除干扰后，取出培养液2滴于白瓷比色板上，用Griess试剂检查有无，如完全没有，则取2滴培养液于白瓷比色板上，加浓硫酸、二苯胺各2滴，若呈现蓝色，说明有硝化作用产生。由此确定数量指标，查 MPN表并求出硝化细菌近似数，换算成每克泥样中硝化细菌的数量。

3.反硝化细菌的测定

培养基：KNO₃ 2.0g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、酒石酸钾钠20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2。将培养基分装于1.8cm×18cm试管中，每管10mL，并加1杜氏小管。121℃（1.05kg/cm²）灭菌30min。操作步骤如下：

（1）制备稀释度为10^-3、…、10^-7、10^-8的基质稀释液，每管培养基中接种稀释液1mL，每一稀释度重复3管，另有1管接种1mL无菌水作为对照，于28～30℃培养14d。

（2）观测培养基是否变浑，然后检查N₂、NH₃、是否产生。检查方法为：①氮气，若有氮气产生，则培养液表面或杜氏小管内聚有气泡；②亚硝酸，取培养液2滴于白瓷比色板上，加Griess试剂，如有红色，说明反硝化作用产生了亚硝酸；③氨，取2滴培养液于白瓷比色板上，加纳氏试剂，若变黄棕色，说明还原产生了氨；④硝酸盐，同硝化细菌的检测步骤。

（3）由上述确定数量指标，查MPN表求出反硝化细菌的数量。

3.4.5.3 硝化潜力测定

将250g新鲜泥样分别放置于玻璃容器底部，加入由去离子水和NH₄Cl配置浓度约为6mg/L的反应液，使玻璃容器中底泥与液面的距离分别与实验河道内各自采样位置的水深一致。实验开始时在保证底泥不被搅动的情况下，采用微小曝气头进行充氧，控制DO浓度为8～10mg/L，与河道水中DO浓度一致，实验在20℃的温室中进行，定时取水样测定 NH₃-N、浓度。在试验期间，通过测定使pH 值维持在7.5～8.5。

3.4.5.4 基质氮释放速率测定

将250g新鲜泥样分别放置于玻璃容器底部，分别加入各自同一深度处采集的并经0.2μm滤膜过滤后的水样，使玻璃容器中底泥与液面的距离分别与实验河道内各自位置的水深一致。实验开始时在保证底泥不被搅动的情况下，采用微小曝气头进行充氧，控制DO浓度为8～10mg/L，与河道水中DO浓度一致，实验在20℃的温室中进行，定时取水样测定浓度。

3.4.5.5 反硝化强度的测定

（1）配制培养基及10^-1底泥悬液。培养基：KNO₃ 0.25g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、酒石酸钾钠20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2。在150mL三角瓶中装30mL培养基，每组2只，121℃（1.05kg/cm²）灭菌30min，冷却至室温，备用；稀释度10^-1底泥悬液的配制方法见3.3.4。

（2）接种培养、测定。用无菌吸管吸取10^-1底泥悬液1mL接种到灭菌后的培养基中，每组接2只三角瓶，其中1只三角瓶过滤立即测定原始培养液中浓度，另一只三角瓶置于28℃培养箱中培养15d后，取出三角瓶，培养液过滤，测定浓度。

（3）计算培养前后浓度差，换算为单位泥样对减少的贡献量，单位为mg/（g·h）。