项目三 食品微生物检验实验室

一、食品微生物检验实验室的基本要求

进行食品微生物检测要有相应的条件，通常包括微生物检验实验室、微生物检验设备与材料、相关检验标准与法规、检验人员等。食品微生物检验实验室的基本要求包括食品微生物检测实验室的管理要求、技术要求、过程控制要求、结果质量保证、操作质量控制以及结果报告的要求。

1.管理要求

（1）目标与任务 食品微生物检验实验室应根据国际通用标准规范，严格食品微生物检验室质量控制规范，提供食品安全检验的技术保证。

（2）组织结构 食品微生物检验实验室应具有明确的法律地位，应避免涉及任何可能会降低其在能力、公正性、判断力或运作诚实性方面可信度的活动，不应因经济或政治的因素而影响检测。检测结果应具有一定的权威性。食品微生物检测实验室要有对良好职业行为、检验工作质量的承诺。

（3）管理体系 食品微生物检验实验室有义务完成职责范围内的食品微生物检测工作，对检出客户要求以外的食源性致病微生物，应将结果报告客户，必要时通知相关部门，并由实验室管理层负责对实验室质量管理体系及全部的食品微生物检测活动进行监督和评审，要由技术管理者全面负责技术工作和所需资源的供应，以保证所要求的工作质量。

（4）文件控制 食品微生物检验实验室的检验工作应遵循国际或国家制定的法规、标准或检验程序等，建立一套用以识别、收集、索引、访问、存放、维护以及安全处置文件的程序。所有记录均应清晰明确，便于检索，并有专人负责应用程序保护和电子形式存储记录的备份，以防止未经授权的侵入和修改。

2.技术要求

（1）检验人员的要求

①食品微生物检验实验室的管理层应保证所有人员工作所必需的设备操作、微生物检测技能（如倒平板、菌落计数、无菌操作等）和实验室生物安全等方面的培训；并有针对所有级别检测人员的继续教育计划。

②检验实验室应由具有一定资质的微生物学或相近专业的人员来操作或指导微生物检测。应按要求根据相应的教育、培训、经验和（或）可证明的技能进行资格确认。检验员的基础知识和基本经历在评审中显得尤其突出。因为微生物检验是通过形态特征、生理生化反应特征、生态特征、血清学反应等来鉴定菌种的，这需要一个受过微生物方面专门培训、具有一定的理论基础，并且具有一定的检验经历的检验人员才能进行食品中微生物的检验。

③检验室管理者应授权专门人员进行特殊类型的抽样、检测、发布检测报告、提出意见和解释以及操作特殊类型的设备。授权的报告签发人应具有相关的工作经验和专业知识，熟悉有关法规和技术要求等。

（2）设施的要求

①实验室环境不应影响检验结果的准确性。微生物检验实验室在选址时，要求周围环境条件良好，尽量避开容易污染以及嘈杂的环境，显微镜和检验操作光线要充足，因此检验室的窗户应尽量朝南，室内的照明灯要有足够明亮度。

②微生物检验实验室应保持整洁，工作台和地面要便于清洁，为了防止蚊蝇等，实验室备纱窗。实验室的设备和辅助用具要根据工作顺序、清洁与污染的情况进行安排，防止交叉污染。典型的检验实验室应有检测设施（专用于微生物检测和相关活动）及辅助设施（大门、走廊、管理区、样品室、洗手间、储存室、文档室等）。某些检测设备可能需要特殊的环境条件。通过自然条件或换气装置或使用空调，保持良好的通风和适当的温度。使用空调时，应根据不同工作类别检查、维护和更换合适的过滤设备。

③食品微生物检验实验室要与准备室分开，两室的地面材料和墙面材料应便于清洗，桌面最好铺有胶皮垫或其他易清洗的材料。一般样品检验应在洁净区域（包括超净工作台或洁净实验室）进行，洁净区域应有明显的标识。

④根据所检测的微生物危害等级的不同，在检验室内穿着相应的防护服（如果需要，包括保护头发、胡须、手和鞋等防护措施），离开工作区域时脱下防护服。当进行检测时，窗和门的张开程度应降低到最小，换气系统中应有空气过滤装置，禁止把植物和个人物品带入实验室工作区域。尽可能减少在实验室进行文件处理。

（3）设备的要求

①食品微生物检验实验室一般应配备的设备见表1-2。

②设备的安装和布局应便于操作，易于维护、清洁和校准。设备应达到规定的性能参数，并符合相关检测指标。无论何时，只要发现设备故障，应立即停止使用，必要时检查对以前结果的影响。应定期验证和维护设备，以确保其处于良好的工作状态。

③应根据使用频率在特定时间间隔内进行维护和性能验证，并保存相关记录。每台对检测质量有影响的设备应有使用记录本并放在设备附近。使用记录本的内容包括：设备名称、制造厂商、主机系列号或其他唯一性标识、设备到货日期及投入使用日期、当前放置地点、收到时的状态（新、旧、重新调试）、制造厂商的操作指南（复印件或其放置位置）等。

④实验室设备应有日常性监控记录和使用记录，包括使用人、使用日期、运行状况等。

（4）培养基的配制和管理

①对试剂的要求：检验实验室应有对试剂进行检查、接收、拒收和储存的程序，确保所用的试剂质量符合相关检测的需要。实验室工作人员应使用有证的国家或国际质控微生物，在初次使用和保存期限内验证并记录每一批对检测起决定性作用的试剂的适用性，不得使用未达到相关标准的试剂。

②检验实验室制备培养基原料（包括商业脱水配料和单独配方组分）应在适当的条件下储存，如低温、干燥和避光。所有的容器应密封，尤其是盛放脱水培养基的容器。不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基。除非试验方法有特殊要求，培养基、试剂及稀释剂配制用水应经蒸馏、去离子或反渗透处理，培养基要求无菌、无干扰剂和抑制剂。

③培养基的管理：培养基是微生物检验的关键试验材料，微生物检验实验室必须对自配或购买的培养基的可靠性采用一定的方法进行鉴定，确保培养基的有效性。如果为自配的培养基则必须保存配制记录。

（5）标准物质和标准培养物 检验实验室可使用来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。将标准菌株传代培养一次，制得标准储备菌株，应同时进行纯度和生化检验。建议使用深度冰冻或冻干的方法制备标准储备菌株。标准储备菌株继代培养便是日常微生物检测所需工作菌株。一旦标准储备菌株被解冻，最好不要重新冷冻和再次使用。所有的标准培养物从储备菌株传代培养次数不得超过5次。

（6）污染废物的处理 正确处理污染材料也许不会直接影响样品分析的质量，但检验实验室应制订方案来减小其污染检测环境或设施的可能性。所有污染废物应在121℃持续灭菌至少45min。污染废物的最终弃置应符合国家、国际环境或健康安全规则。

3.过程控制要求

（1）数据记录 检验过程中应及时、准确地记录观察到的现象、结果和数据等信息。一般情况下不能对原始记录数据进行更改，但涉及仪器设备等特殊原因必须要经过许可且要对修改数据进行标记并签字方可生效。

（2）实验室应定期对实验用菌种、培养基、试剂等设置阳性对照、阴性对照和空白对照。

（3）实验室应对重要的检验设备（特别是自动化检验仪器）设置仪器对比。

（4）实验室应定期对实验人员进行技术考核和人员比对。

4.结果控制要求

检验实验室应制订周期性检查程序以证实检测可变性（例如分析者之间的差异和设备或材料之间的差异等）处于控制之下，该程序应覆盖检验实验室的所有检测项目。检验实验室应尽可能参加与其检测范围相关的外部质量评估计划（如能力验证）和检验实验室对比试验。

5.检测报告的要求

检验实验室应准确、清晰、明确和客观地报告每一项或一系列检测的结果，并符合检测方法中规定的要求。应制订政策及程序，确保检测结果只能送达被授权的接收者。

二、无菌室设计的基本要求

微生物检测的核心是进行无菌操作，以保证环境中的微生物不进入样品中，从而保证结果的准确性。为了保证无菌操作，食品微生物检测需要在无菌室中进行，所有与待检样品接触的用具、材料都要经过灭菌或消毒。

1.无菌室设计的基本要求

（1）无菌室大小应能够满足检验工作的需要，内墙为浅色，墙面和地面应光滑，墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，无死角，易于清洁和消毒。

（2）无菌室入口处应设缓冲间，缓冲间有足够的面积以保证操作人员更换工作服及鞋帽。

（3）缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置。

（4）用紫外线消毒物品表面时，应使照射表面受到紫外线的直接照射，且应达到足够的照射剂量。

（5）无菌室关键操作点及超净工作台操作区的净化级别应为100级。

2.无菌室的使用与管理

（1）无菌室应保持清洁整齐，室内仅存放最必需的检验用具，如酒精灯、酒精棉、火柴、镊子、接种针、接种环、玻璃铅笔等。

（2）室内检验用具及桌凳等位置保持固定，不随便移动。

（3）每2～3周用2%石炭酸水溶液擦拭工作台、门、窗、桌、椅及地面，然后用甲醛加热或喷雾灭菌，最后使用紫外灯杀菌0.5h。

（4）定期检查室内空气无菌状况，发现不符合要求时，应立即彻底消毒灭菌。

无菌室无菌程度的测定方法：取普通肉汤琼脂平板、改良马丁培养基平板各3个（平板直径均90mm），置无菌室各工作位置上，开盖暴露30min，然后进行倒置培养，测定细菌总数应置于37℃恒温箱中培养48h，测定霉菌则应置于28℃恒温箱中培养5天。细菌、霉菌菌落总数均不得超过15个为合格。

（5）无菌室在使用前后应进行有效地消毒，在无菌室无人时可采取紫外线消毒，照射时间≥30min。室内温度＜20℃或＞40℃、相对湿度＞60%时，应适当延长照射时间。

（6）进入无菌室前，必须于缓冲间内更换经过消毒处理的工作服、工作帽及工作鞋。

（7）检验操作过程中应严格按照无菌操作规定进行，以保持环境的无菌状态。

三、微生物检验的器皿要求

1.器皿的清洗与包扎

（1）新购置的玻璃器皿 应用5%氢氧化钠和3%稀酸分别浸泡24h后清洗使用。

（2）用过的玻璃器皿 凡被病原微生物污染过的玻璃器皿，在洗涤前须进行严格地灭菌或消毒，再使用洗涤剂清洗，用清水反复清洗数次，最后再用蒸馏水冲洗3次，倒置于干燥架上自然晾干，或控干水分后放入烘箱中烘干。

（3）器皿包扎 移液管应先在管口塞入脱脂棉少许（不得过紧或过松），再用牛皮纸或报纸包扎后，装入金属桶以干热方法灭菌；玻璃平皿9个一摞用牛皮纸或报纸包扎后干热灭菌。

2.消毒灭菌要求

微生物检验用器材及场所以及检测用到的玻璃器皿、金属用具及培养基等，必须进行灭菌或消毒处理，不同对象采用不同的处理方法。

（1）湿热高压蒸汽灭菌 微生物检验所用的稀释液、培养基等用高压灭菌锅进行湿热灭菌。所有需要灭菌的物品在灭菌之前需要清洗晾干，装入培养基等，加塞，用封口膜或纸包装严密，再放入高压灭菌锅内灭菌。一般采用115℃或121℃灭菌20min，当然不同的培养基有不同的要求，应分别处理。

（2）干热灭菌 在高温下不损坏、不变质、不蒸发的物品可采用干热灭菌，较常用于各种玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等。干热灭菌是将所需灭菌物品于干燥箱中160℃灭菌2h或180℃灭菌1h。

微生物检验过程中如选择一次性灭菌用品来代替反复使用的物品或材料，例如一次性培养皿、吸管、吸头、试管、接种环等，使用前无需再次灭菌，但在使用前要确保其包装完整。

（3）火焰灭菌 火焰灭菌即使用酒精灯火焰的外焰进行灭菌的一种方式，一般对接种针、接种环等进行火焰灭菌。

（4）一般消毒 无菌室内的凳、工作台、试管架、天平、待检物容器或包装均无法进行灭菌，必须用其他方法进行消毒处理，采用2%石炭酸或来苏水溶液擦拭消毒，工作人员的手用75%的酒精擦拭消毒。

（5）灭菌记录 对检验用品的灭菌应记录灭菌（或消毒）的温度与持续时间，灭菌后检验用品应妥善的储存。如果灭菌后长时间不用，下次使用前要重新灭菌。

（6）应注意交叉污染 已灭菌与未灭菌的用品应分开存放并明确标识。灭菌后的检验用品其储存环境应保持干燥和清洁。实验室应该配有专用于污染物处理的灭菌设备。

四、微生物检验的无菌操作要求

食品微生物检验实验室的工作人员，必须有严格的无菌观念，主要原因一是防止操作中人为污染样品；二是保证工作人员的安全，防止由于操作不当而造成个人污染。

1.准备工作

（1）先进行无菌室空间的消毒，开启紫外灯30～60min即可。

（2）检验有关的材料在放入无菌室前必须经过灭菌。

（3）检验操作时穿着的工作服、帽和鞋等应放在无菌室缓冲间，使用前经紫外线消毒。操作人员必须将手清洗消毒，穿戴好消毒后的工作服、帽和鞋，才能进入无菌室。

（4）操作过程中可能产生潜在感染性物质喷溅的，操作人员应将面部、口和眼遮住或采取其他防护措施。

（5）检验人员在开始检验操作前必须再一次消毒手部，方能开始操作。

2.操作过程注意事项

（1）动作要轻，不能太快，以免搅动空气增加污染；玻璃器皿也应轻取轻放，以免其破损并污染环境。为了避免感染性物质从移液管中滴出而扩散，在工作台面应当放置一块吸有消毒液的纸，使用后将其按感染性废弃物处理。

（2）进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌。打开包装但未使用完的器皿，不能放置后再使用。金属用具应髙压灭菌或用95%酒精灼烧灭菌3次后使用。

（3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位。用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边缘。若使用移液枪操作，则移液枪的枪头不能触及外露部位及平皿边缘。

（4）接种、转种菌体必须在酒精灯前操作，吸管从包装中取出及打开试管塞，都要通过火焰消毒。

（5）接种环、接种针等金属器材使用前后均需灼烧，灼烧时先通过内焰，使残留物灼烧干净后再用外焰灭菌。为了避免被接种物洒落，微生物接种环的直径应为2～3mm并完全封闭，柄长度应小于6cm以减小抖动。使用封闭式微型电加热器消毒接种环，能够避免在明火上加热所引起的感染性物质爆溅。最好使用不需要再次灭菌的一次性接种环。

（6）使用吸管时，切勿用嘴直接吹吸吸管，而必须使用洗耳球、吸头操作，或使用移液器操作。不能向含有感染性物质的溶液中吹入气体。

（7）观察平板时不要开盖，如需挑取菌落检査时，必须靠近火焰区操作，平皿盖也不能大开，而是上下盖适当开缝。

（8）进行可疑致病菌涂片染色时，应使用夹子夹持载玻片，切勿用手直接拿载玻片，以免造成污染，用过的载玻片也应置于消毒液中浸泡消毒，然后再洗涤。

（9）工作结束，收拾好工作台上的样品及器材，最后用消毒液（含1%有效氯的溶液或3%过氧化氢的溶液）擦拭工作台。

五、微生物检验的废弃物处理

（1）对于培养物及其污染的物品，如斜面、测试条、生物鉴定管、血清学鉴定用载玻片、细菌培养平皿、注射器等，应使用适当浓度的消毒剂处理一定时间，或采用121℃高压灭菌至少45min，或其他有效处理措施。

（2）将处理后的废弃物倒入特殊标识的垃圾袋内，直接送到指定地点。

（3）记录并保留废弃物和实验动物尸体处理的记录。

工作任务实施

独立对微生物检验所使用的超净台进行无菌环境的检测，并填写工作文件。

1.请仔细观察你所在的微生物实验室，列出该实验室的主要设备及型号，并试着描述其在检验中的作用

2.进行检验操作前的准备工作，并填写相关记录

（1）湿热高压灭菌

（2）干热灭菌操作

（3）超净工作台紫外线灭菌

3.超净工作台无菌环境测定

检测方法：参看学习资料。

4.结果分析及检测报告的撰写

5.实验后整理