项目一 显微镜的使用

显微镜可分为电子显微镜和光学显微镜两大类。光学显微镜包括：明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜、立体显微镜等。其中明视野显微镜为最常用普通光学显微镜，其他显微镜都是在此基础上发展而来的，基本结构相同，只是在某些部分作了一些改变。明视野显微镜简称显微镜。

一、光学显微镜的构造

普通光学显微镜的构造可以分为机械系统和光学系统两大部分，见图2-1。

1.机械系统

机械系统包括以下部件：

（1）镜座（Base） 在显微镜的底部，呈马蹄形、长方形、三角形等。

（2）镜臂（Arm） 连接镜座和镜筒之间的部分，呈圆弧形，作为移动显微镜时的握持部分。

（3）镜筒（Tube） 位于镜臂上端的空心圆筒，是光线的通道。镜筒的上端可插入接目镜，下面可与转换器相连接。镜筒的长度一般为160mm。显微镜分为直筒式和斜筒式；有单筒式的，也有双筒式的。

（4）旋转器（Nosepiece） 位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有3～4个孔，用于安装不同放大倍数的接物镜。

（5）载物台（Stage） 是支持被检标本的平台，呈方形或圆形。中央有孔可透过光线，台上有用来固定标本的夹子和标本移动器。

（6）调焦旋钮 包括粗准焦螺旋（Coarse adjustment knob）和细准焦螺旋（Fine adjustment knob），是调节载物台或镜筒上下移动的装置。

2.光学系统

（1）接物镜（Objective lens） 常称为镜头，简称物镜，如图2-2所示。物镜由许多块透镜组成，是显微镜中最重要的部分，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体，故又称接物镜，其作用是将标本上的待检物进行放大，形成一个倒立的实像。一般显微镜有3～4个物镜，根据使用方法的差异可分为干燥系和油浸系两组。干燥系物镜包括低倍物镜（4～10×）和高倍物镜（40～45×），使用时物镜与标本之间的介质是空气；油浸系物镜（90～100×）在使用时，物镜与标本之间加有一种折射率与玻璃折射率几乎相等的油类物质（香柏油）作为介质。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如：NA0.30；10×；160/0.17；16mm。其中“NA0.30”表示数值孔径（numerical aperture，简写NA），“10×”表示放大倍数，“160/0.17”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度（mm），16mm表示焦距。

（2）接目镜（Eyepiece lens） 通常称为目镜，装于镜筒上端，一般由2～3块透镜组成。其作用是将由物镜所形成的实像进一步放大，并形成虚像而映入眼帘，不增加分辨力。目镜上面标有7×、10×、15×等放大倍数，可根据需要选用，可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500～700倍，最大也不能超过1000倍的选择。目镜的放大倍数过大，反而影响观察效果。一般显微镜的标准目镜是10×。

（3）聚光镜（Condenser） 位于载物台的下方，由两个或几个透镜组成，其作用是将由光源射出的光线聚成光锥照射标本，增强照明度和造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光镜可以通过位于载物台下方的聚光镜调节旋钮进行上下调节，以求得最适光度。聚光器还附有虹彩光圈（Iris diapHragm），由薄金属片组成，中心形成圆孔，推动把手可随意调整透进光的强弱，即调节锥形光拄的角度和大小，以控制进入物镜的光的量。

（4）光源（Light source） 较新式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内，通过按钮开关来控制。老式的显微镜大多是采用附着在镜臂上的反光镜，将日光或灯光放射进入聚光镜。反光镜是一个双面镜，一面是平面，另一面是凹面，起着把外来光线变成平行光线进入聚光镜的作用。在使用低倍和高倍镜观察时，用平面反光镜；使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。使用内光源的显微镜就无需反光镜。

（5）滤光片（Filter） 可见光是各种颜色的光组成的，不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的，分别透过不同波长的可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。

二、光学显微镜的基本原理

现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故也常称为复式显微镜。标本经物镜放大后，在目镜的焦平面上形成一个倒立实像，再经目镜进一步放大形成一个虚像，被人眼所观察到，如图2-3所示。

在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配制的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需要在载玻片与油镜之间滴加香柏油，其主要目的是增加照明亮度和提高显微镜的分辨率。因香柏油的折射率（n=1.51）与玻璃的折射率（n=1.52）几乎相等，故透过载玻片的光线通过香柏油后，直接进入物镜，而不发生折射。两组物镜光线通路的区别，如图2-4所示。

衡量显微镜性能好坏的指标主要是显微镜的分辨率，显微镜的分辨率（Resolving power）是指显微镜将样品上相互接近的两点清晰分辨出来的能力。它主要取决于物镜的分辨能力，物镜的分辨能力是所用光的波长和物镜数值口径的函数。分辨率用镜头所能分辨出的两点间的最小距离表示，距离越小，分辨能力越好。可用式（2-1）表示：

式中 λ——光波波长，光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4～0.7μm）；

NA——物镜的数值孔径值，表示从聚光镜发出的锥形光柱照射在观察标本上，能被物镜所聚集的量，可用式（2-2）表示：

式中 n——标本和物镜之间介质的折射率；

θ—由光源投射到透镜上的光线和光轴之间的最大夹角。

光线投射到物镜的角度越大，数值口径就越大。如果采用一些高折射率的物质作介质，如使用油镜时采用香柏油作介质，则数值口径增大，从而提高分辨能力。物镜镜筒上标有数值口径，低倍镜为0.25，高倍镜为0.65，油镜为1.25。这些数值是在其他条件都适宜的情况下的最高值，实际使用时，往往低于所标的值。

三、光学显微镜的使用

1.观察前的准备

（1）显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约3～4cm。镜检时姿势要端正。

（2）光源调节 安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。

（3）调节双筒显微镜的目镜 根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应瞳距不同或两眼视力有差异的不同观察者。

（4）聚光器数值孔径的调节 调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转换一次物镜都应进行这种调节。

2.显微观察

在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者进行显微镜观察时，应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对较大，容易发现目标及确定检查的位置。

（1）低倍镜观察 将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降10×物镜，使其接近标本，用粗准焦螺旋慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细准焦螺旋调节图像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。

（2）高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移到视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调整后微调细准焦螺旋使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。

（3）油镜观察 在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗准焦螺旋将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗准焦螺旋将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中并与标本相连。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若使用聚光器的数值孔径值超过了1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也滴加香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野的亮度合适，用粗准焦螺旋将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细准焦螺旋使其清晰聚焦为止。

3.显微镜用毕后的处理

（1）升镜筒，取下载物片。

（2）用擦镜纸拭区镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（或乙醚∶乙醇=7∶3的混合液）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。

（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。

（4）将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋，同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。

（5）将显微镜放回原处。

4.光学显微镜的使用注意事项

（1）拿取显微镜时，需双手握取。

（2）开关光源时，应将亮度调节器调到最小；暂时离开时，将亮度调到最小，不需关闭光源，以延长灯泡使用寿命。

（3）转换物镜时，先将载物台降低，然后在注视情况下升高载物台，以免压碎载玻片。

（4）在进行高倍镜头切换的时候，一定要按从低倍到高倍顺序，否则容易打坏镜头，还会污染低倍物镜。

（5）使用过程中，随时保持显微镜清洁。

（6）显微镜使用完毕，请先将电压调节至最小后再关掉电源，防止下次开机时电压过高而烧毁灯泡。

（7）显微镜使用完毕后，特别是使用汞灯照明后，不要立即盖上防尘罩，否则热量散发不出去，影响灯泡和灯箱的使用寿命，还有引发火灾的隐患。

（8）显微镜长时间不用时，要将载物台降低到最低，旋转物镜转盘让物镜偏离正中位。

（9）显微镜的任何光学部件都不可以干擦，必须用好的擦镜纸或者棉签蘸清洗液擦洗。特别注意擦之前一定要用吹气球先吹掉大的灰尘颗粒。