第一节 基础性实验

一、光学显微镜的使用及微生物形态的观察

普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。早期的显微镜仅由少数几块透镜组成，难以消除物像的像差和色差。近代的显微镜由一套精密磨制的透镜组成，已能较好地消除像差和色差，并能将物体放大1500～2000倍。

（一）实验目的

（1）掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养。

（2）观察细菌的个体形态。

（3）学习生物图的绘制方法。

（二）实验内容

（1）仪器和材料 光学显微镜、擦镜纸、香柏油、标本片。

（2）实验内容及操作步骤

①做好实验前的准备工作。

②显微镜低倍镜、高倍镜的操作。先用低倍镜观察，旋转转换器换高倍镜，应注意避免与标本片相碰。

③油镜的操作。

④观察并绘制微生物个体形态简图。

⑤擦拭镜头和标本片。

⑥将所用仪器归位。

（3）显微镜的构造 显微镜分机械装置和光学系统两部分（图1-1）。

①机械装置

镜筒：镜筒上端装目镜，下端接转换器。

转换器：转换器装在镜筒的下方，其上有3～5个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。

载物台：载物台为方形（多数）和圆形的平台，中央有一光孔，孔的两侧各装一个夹片，载物台上还有移动器（其上有刻度标尺），可纵向和横向移动，移动器的作用是夹住和移动标本。

镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式（可改变倾斜度）两种。

镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。

调节器：包括大、小螺旋调节器（调焦距）各一个，可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。调节器有装在镜臂上方或下方两种，装在镜臂上方的是通过升降镜臂来调焦距，装在镜臂下方的是通过升降载物台来调节焦距，新式显微镜多半装在镜臂的下方。

②光学系统

目镜：显微镜一般备有几个不同规格的目镜。例如，10倍（10×）、16倍（16×）。

物镜：物镜装在转换器的孔上，物镜有低倍（8×、10×、20×）、高倍（40×）及油镜（100×）。显微镜的总放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。

聚光镜：聚光镜安装在载物台的下面，反光镜反射来的光线通过聚光器被聚集成光锥照射到标本上，可增强透明度，提高物镜的分辨率。聚光镜可上下调节，它中间装有光圈，可调节光亮度，在看高倍镜和油镜时需调节聚光镜，合理调节聚光镜的高度和光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。

反光镜：反光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面镜，为灯光时用凹面镜。

蓝滤色片：需用滤光片时，可将滤光片放在聚光镜下可变光栏拖架上。

（4）显微镜的操作

①低倍镜的操作

a.置显微镜于固定的桌上。

b.旋转转换器，将低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒对正。

c.打开灯光，同时用眼对准目镜，使视野亮度均匀。

d.将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔的正中。

e.孔径光栏的调节。通常，当孔径光栏开启到物镜出瞳的70%～80%时，就可以得到足够对比度的良好图像。要观察孔径光栏像，可取下目镜，从空目镜筒中往下看物镜出瞳。具体如图1-2所示。

f.转轴式双目镜筒调节

瞳距调节：转轴式双目镜筒的瞳距标志在上表面的黑色圆形刻度板上，瞳距范围为55～75mm，以满足不同操作者的瞳距要求，使左、右目镜中的图像合并。

视度的调节：转动视度圈，使视度圈上的零刻度线与其下端的白点对齐，此时是零视度位置，对于左右眼视度不等的操作者，调节视度，可达到双眼同时看清图像的目的。

g.将粗调节器向下旋转（或载物台向上旋转），眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。当物镜的尖端距载玻片0.5cm处时停止旋转。

h.左眼向目镜里观察，将粗调节器向上旋转，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细调节器调节，至目的物清晰为止。

i.如果粗调节器旋得太快，使超过焦点，必须从g步重调，不应正视目镜情况下调粗调节器，以防没把握的旋转使物镜与载玻片相碰撞坏。

j.观察时两眼同时睁开（双眼不感疲劳）。单筒显微镜应习惯用左眼观察，以便于绘图。

②高倍镜、油镜的操作

a.如果用高倍镜观察目的物未能看清，可用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。

b.在载玻片上滴一滴香柏油（或液体石蜡），将油镜移至正中，使油镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。如果有气泡进入油层，会使像质变差，要驱出气泡，可转动转换器若干次或再加一点油，再使用调节器微微向上调（切记不能用粗调节器）即可。

c.油镜观察完毕，用擦镜纸将镜头上的油擦净，另用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，再用擦镜纸擦干。

（5）显微镜的维护与保养

显微镜的光学系统是显微镜的主要部分，尤其是物镜和目镜。

①避免直接在阳光下曝晒。

②避免和挥发性药品或腐蚀性酸类一起存放，碘片、酒精、盐酸和硫酸等对显微镜金属质机械装置和光学系统都是有害的。

③透镜的清洁最好用柔软的刷子或纱布，更多的较顽固的污迹可以用干净的软棉布、镜头纸或纱布蘸上无水酒精轻轻地擦去。欲从油浸物镜上擦去浸油，应使用镜头纸蘸上二甲苯轻轻擦去。同时注意不要用二甲苯清洗双目镜筒底部的入射透镜或目镜筒内的棱镜表面。纯酒精和二甲苯均易燃烧，在将电源开关打开或关闭时特别要当心着火。

④不能随意拆卸显微镜，尤其是物镜、目镜、镜筒。机械装置经常加润滑油，以减少因摩擦而受损。

⑤当显微镜不用时，要用塑料罩盖好，并贮放在干燥的地方以免发霉。

⑥为保持显微镜的性能，建议进行定期检查。

（三）微型后生动物个体形态的观察

1.仪器和材料

（1）显微镜、擦镜纸、吸水纸。

（2）酵母菌、霉菌示范片、藻类培养液及活性污泥混合液（内有原生动物和微型后生动物）。

2.实验内容和操作方法

（1）严格按显微镜的操作方法，用低倍镜和高倍镜观察酵母菌和霉菌的示范片，绘制形态图。

（2）用压滴法制作藻类、原生动物和微型后生动物的标本片。制作方法如图1-3所示。取一片干净的载玻片放在实验台上，用一支滴管吸取试管中藻类培养液于载玻片的中央，用干净的盖玻片覆盖在液滴上（注意不要有气泡）即成标本片。用低倍镜和高倍镜观察。

（3）用压滴法观察活性污泥中的原生动物和微型后生动物。

（四）思考题

（1）简述显微镜包括哪些部分？

（2）使用油镜前为什么要先用低倍镜和高倍镜检查？

二、微生物的计数

（一）实验目的

（1）掌握细菌的直接计数法技术。

（2）学会几种细菌直接计数法的应用。

（二）实验原理

细菌直接计数法包括计数板法、涂片染色法、比例计数法等，计数板法最为常用。该法是根据测定对象选用特制的载玻片（即计数板），其上刻有已知面积的大小方格（即计数格），当盖上盖玻片后，盖玻片与计数格间的高度为已知，因此计数格的容积为一定。根据在显微镜下测得的该计数格中的微生物个数，可换算出单位体积待测液中所含微生物数。

（三）实验仪器

显微镜、血球计数板、吸管、盖玻片等。

（四）实验试剂

香柏油、酒精、待测菌液。

（五）实验操作

1.血球计数板的构造

血球计数板是一种专门用于计数较大单细胞微生物的一种仪器，由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的，玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室。这一大方格的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其容积为0.1mm³，即1mm×1mm×0.1mm方格的计数板，其平面及纵切面图如图1-4（a）（b）所示。图1-4（c）为放大后的计数格，在显微镜下，可见众多的大小方格与长格，一般是以小方格为基础进行测数，每一小方格面积为1/400mm²（见计数板上的标注）。

2.操作步骤

（1）稀释 将样品稀释到合适的浓度，一般将样品稀释到每一中方格中有15～20个细胞为宜。

（2）加样 取已洗净的血球计数板，将盖玻片盖住中央计数室，用无菌吸管吸取经充分摇匀并打散开的待测菌液，小心地滴一小滴于盖玻片边缘（勿过多），菌液自行渗入并布满计数格处，注意勿产生气泡。

（3）显微计数 加样后静置3～5min，镜检。根据受检微生物的个体大小选用适宜的接物镜头，先用低倍镜找好计数室位置，然后换用高倍镜进行计数。计数前如发现菌液过浓，可稀释一定倍数后再镜检计数，一般以每小方格内有5～10个菌体为宜。按对角线取点，至少计数20个大方格中的微生物细胞数。计数时注意转动细调节器，使液层上下菌数都可测到，每份菌液样品至少计数两次，取其平均值。

（4）结果计算 以高度为0.1mm的血细胞计数板为例：

①先求出每小方格（即1/400mm²）中的平均菌数A。

②每毫升（mL）菌液中的总菌数=A×400×1000×稀释倍数。

（5）清洗 血球计数板使用完毕后，在水管下用水冲洗，切勿用硬物洗刷，冲洗后风干即可。如镜检发现小格内有残留菌体或其他沉淀物，则需重复洗涤至干净为止。

（六）思考题

如何减少测定结果的误差？

三、微生物的染色

（一）实验目的

学习微生物的染色原理、染色的基本操作步骤、无菌操作技术，学习细菌的单染色和革兰染色法。

（二）实验原理

用于生物染色的染料主要有碱性、酸性和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸时培养基pH下降，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

1.单染色法

单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用单染色即可。但此方法难于辨别细菌细胞的构造。

2.复染色法

用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌。主要的复染色法有革兰染色法和抗酸性染色法。抗酸性染色法多在医学上采用。

革兰染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰法可将所有的细菌区分为革兰阳性菌（G⁺）和革兰阴性菌（G^-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法能将细菌分为G⁺菌和G^-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G^-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G⁺菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

（三）仪器和器材

（1）显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯。

（2）石炭酸复红染色液、草酸铵结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、番红（沙黄）复染液。

（3）枯草杆菌、大肠杆菌。

（四）实验方法

1.细菌的简单染色步骤

（1）涂片 取干净载玻片一块，在正面边角做个记号，并滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。无菌操作步骤如图1-5所示。

（2）干燥 让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用温火烘干。注意不要在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。

（3）固定 手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定（以不烫手为宜）。

（4）染色 在载玻片上滴加染色液（石炭酸复红染色液或草酸铵结晶紫染色液任选一种），使染液在涂有细菌的部位作用约1min。

（5）水洗 倾去染液，斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至水呈无色为止。

（6）干燥 将载玻片倾斜，用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，注意勿将细菌擦掉。

（7）镜检 用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。

2.细菌的革兰染色步骤

先用草酸铵结晶紫染色，经碘—碘化钾（媒染剂）处理后用乙醇脱色，最后用番红液复染。如果细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被乙醇脱色，用番红液复染后仍呈紫色者为革兰阳性菌。被乙醇脱色，用番红液复染后呈红色者为革兰阴性菌。

（1）涂片 方法与单染色涂片相同。

（2）晾干 与单染色法相同。

（3）固定 与单染色法相同。

（4）结晶紫染色 用结晶紫染液染1min，水洗。

（5）媒染 加碘液媒染1min，水洗。

（6）脱色 将载玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20～25s至流出液无色，立即水洗。注意为了节约乙醇，可将乙醇滴在涂片上静置30～45s，水洗。

（7）复染 用番红染液复染1～5min，水洗。染色结果如图1-6所示。

（8）干燥 与单染色法相同。

（9）镜检 用显微镜观察。先用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰染色的结果。

（五）实验完毕后的处理

（1）将浸过油的镜头按正确方法擦拭干净。先用擦镜纸将油镜上的油擦去，再用擦镜纸蘸少许二甲苯将镜头擦2～3次，最后用干净的擦镜纸将镜头擦2～3次。注意擦镜时向一个方向擦拭。

（2）使用后的染色载玻片用废纸将香柏油擦干净。

（六）注意事项

（1）革兰染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰阴性菌也会被染成革兰阳性菌。

（2）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去载玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

（七）思考题

（1）细菌涂片为什么不能过厚？

（2）通过革兰染色，你认为它在微生物学中有何实践意义？