自1998年Fire等证实了dsRNA介导RNAi干扰现象的作用以来，现已发现多种非编码RNA，包括微小RNAs（microRNAs，miRNAs）、小干扰RNAs（small interfering RNAs（siRNAs）、piwi-interacting RNAs（piRNAs）和长链非编码RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）。小分子RNA长度为22～30个核苷酸，通过与Argonaute（Ago）家族蛋白相互作用而调控靶基因的表达。然而，各种小分子RNA在发生方式、Ago蛋白复合体的组成成分以及基因的调控模式等方面也存在不同之处，如miRNA是由生物体基因组自身形成的内源性小分子RNA，而siRNA则主要是外源性的RNA（如病毒、转座子和外源基因导入等）。miRNA是由茎环结构前体形成，而siRNA是由双链RNA剪切后产生。miRNA和siRNA的产生需要Dicer酶的参与，而piRNA是非Dicer酶依赖性的（表3-3）。lncRNA是指长度大于200个核苷酸的非编码RNA转录本，在调节生长发育、细胞定向分化、亚细胞结构分布、进化选择和人类疾病的关系等方面有重要作用。

1998年，Fire和Mello等在秀丽隐杆线虫中证实了RNA干扰是由dsRNA所介导的。病毒感染、反向重复转基因或转录异常产物均可以产生dsRNA，经酶促反应产生siRNA进而介导RNAi。siRNA首先发现于植物中，随后证实在动物中也存在siRNA。siRNAs依据产生过程、调控方式和大小可以分为不同的种类。

外源性长链dsRNA经dsRNA特异性Ⅲ型核糖核酸酶Dicer（Dcr）切割为siRNA。siRNA长约21个核苷酸，具有5′磷酸末端和3′羟基末端，而且在每条单链的3′端存在两个核苷酸的突出末端。在两条链中，介导沉默的链称为guide链，另外一条链称为passenger链。siRNA介导的基因调控是通过RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducing silencing complex，RISC）实现的。在哺乳动物和线虫中只存在一种Dicer，它负责miRNA和siRNA的形成，而在果蝇中有两种形式的Dicer，其中Dcr-1负责产生miRNA，Dcr-2专门用于siRNA的生成过程。在果蝇中RNAi用于防御病毒的感染，因此Dcr-2能够缓解miRNA产生和病毒dsRNA诱导siRNA形成过程中对Dicer酶的需求竞争。在线虫中，到目前为止还没有发现天然病毒的感染，而人类具有免疫系统，所以不需要RNAi过程防御病毒感染。

在植物中，外源性siRNA不仅仅可以由dsRNA产生，由串联重复片段或者高表达的单拷贝转基因产生的转录子可经RNA依赖的RNA聚合酶家族成员（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）RDR6转变为dsRNA。RDR6和RDR1也可以将病毒单链RNA转变为dsRNA，从而引起抗病毒反应。

内源性siRNAs最早发现于植物和秀丽隐杆线虫中，但是最新研究结果表明在果蝇和哺乳动物中也存在内源性的siRNA，这表明内源性siRNA在高等真核生物中是普遍存在的。

A.植物内源性siRNA：在植物中，顺式作用siRNAs（cis-acting siRNAs，casiRNAs）来源于转座子、重复片段以及串联重复片段如5S rRNA。casiRNAs通过对其来源基因座进行DNA甲基化和组氨酸修饰而促进异染色质的形成。另一类植物内源性siRNA是反式作用siRNA（trans-acting siRNA，tasiRNAs），tasiRNA是miRNA和siRNA通路共同作用的产物。特定转录子经miRNA介导的切割产生单链RNA，单链RNA在RDR6的作用下形成dsRNA，并最终形成siRNA。

B.动物内源性siRNAs：在植物和线虫中，内源性siRNAs的产生需要RdRPs的参与，但是在果蝇和哺乳动物不编码RdRP蛋白，然而果蝇和哺乳动物依然能够产生内源性的siRNAs。第一个内源性哺乳动物siRNA的发现源自于对长散在重复序列反转录转座子的研究，并在哺乳动物细胞中检测到。全长LINE-1在5′-UTR中含有正义和反义启动子，因此可以进行双向转录从而产生具有重叠区域的互不配对的转录子，该转录子在Dicer酶作用下形成siRNA。果蝇中内源性siRNA来源于转座子、异染色质序列、基因间序列和长的RNA转座子，甚至可以由mRNA形成。

在RNAi通路中，siRNA guide链指导RISC复合物作用于与guide链完全匹配靶目标RNA从而使其发生降解。RNA的降解是由Ago蛋白的PIWI结构域引发的，这种降解过程是非常精确的：切割发生在与siRNA中的第10和11个碱基（从siRNA 5′端计数）配对的RNA链中的两个碱基所形成的磷酸二酯键上，产生含有磷酸基团的5′端和羟基基团的3′端。最初的切割完成以后，细胞中的核酸外切酶继续作用于最初切割产生的片段进而完成整个降解过程。由RISC形成的3′羟基末端也是寡聚尿苷化反应中的底物，寡聚尿苷化后同样促进了细胞核酸外切酶的降解作用。在RISC中完成切割后，靶目标从siRNA上脱离，同时释放RISC用来完成对其他底物的切割。有些研究结果发现，高度纯化的RISC复合物在切割底物的过程中不能够循环使用，这说明RISC的释放还需要其他辅助因子的参与，并且很有可能是由ATP水解作用所驱动的。

转录后siRNA沉默的效应阶段主要发生在细胞质中，siRNA的结合诱导Ago蛋白定位于P小体（processing body，P-body）中，P小体中富集有mRNA降解所需的各种因子。但是P小体并不是RNAi所必需的，在细胞核内同样可以发生RNAi。荧光相关谱（fluorescence correlation spectroscopy，FCS）和荧光互相关谱（fluorescence cross-correlation spectroscopy，FCCS）的应用让我们直接观察到核内的RISC比胞质中的小。对秀丽隐杆线虫中核内RNAi过程中的因子进行遗传筛选发现，Ago蛋白Nrde-3在siRNA诱发前位于细胞质内，而siRNA诱发后它移位至细胞核内。这个研究结果表明RNAi因子的定位是动态变化的，沉默复合物可以广泛分布于细胞内。

2002年研究者发现，siRNA不仅仅可以在转录后发挥抑制作用，siRNA在裂殖酵母（ S.pombe）中可以诱导异染色质的形成，这与之前植物中的基因翻译沉默（transcriptional gene silencing，TGS）报道相一致。RNA沉默与异染色质之间的直接联系随后在动物、植物和纤毛虫中得到证实。siRNA诱发异染色质的形成机制在芽殖酵母（ S.pombe）中研究最为透彻。在裂殖酵母中含有Ago1的效应复合物被称为RNA诱导的转录沉默复合物（RNA-induced transcriptional silencing，RITS），在siRNA的指导下RITS结合于特定的染色体基因座如着丝粒重复区。在现有siRNA诱导异染色质形成模型中，RITS与RNA聚合酶Ⅱ相互作用促进了siRNA对转录子的识别。RITS促进甲基化转移酶对组氨酸H3第九位赖氨酸（H3K9）的甲基化，从而超募含有染色质修饰结构域的Swi6蛋白，并促进了染色质的压缩。RITS还可以激活RNA依赖的RNA聚合酶复合物（RNA-dependent RNA poly merase complex，RDRC），RDRC通过其亚基Rdp1产生第二条siRNA来增强和扩大沉默作用。TGS在植物中也进行了详细的研究，结果与裂殖酵母中呈现很多的相似性，但也存在较大的不同，如在植物中除了组氨酸甲基化，还存在由DNA甲基化转移酶介导的甲基化等。

piRNAs是最新发现的一类小分子单链非编码RNA，长度为24～32个核苷酸，因其可以与Ago家族中的Piwi相互作用而得名，Piwi蛋白在不同的种属中分为不同的种类，如在果蝇中分为Piwi、Aubergine（Aub）和Ago3，在小鼠中为MILI、MIWI和MIWI2，在人类中则为HILI、HIWI2和HIWI3。piRNA来源于基因组中基因间隔区重复元件，即piRNA簇。piRNA序列多样化，到目前为止在果蝇中已经发现了150多万条piRNA，定位于数百个基因簇中。piRNA跨越基因组中一个较大的区域，有时甚至超过100kb，主要由不同种类的转座DNA元件及其残余序列构成。因此，piRNA，尤其是果蝇性腺和小鼠粗线期前期的piRNA富含转座子元件。大多数piRNA与转座子转录子具有相反的定向，因此可以与转座子转录本杂交从而引发沉默。piRNA是生殖细胞基因组卫士，它能够保护基因组免受转座子元件的侵扰，其功能丧失的动物表现为配子发生缺陷及不育性，而且后代也表现为相同的性状。因此piRNA通路可以在转录水平和（或）转录后水平上抑制转座子的活性。

piRNA的产生过程如下：

来源于piRNA簇的新生转录本经处理后形成piRNA样分子，该分子随后与PIWI蛋白结合（见图3-1）。piRNA簇转录及调控相关的分子目前还不清楚，目前认为piRNA样分子在与PIWI结合之前piRNA的5′端已经建立，然而piRNA的3′端还含有多余的碱基，这些碱基会在与PIWI蛋白结合后去除，但目前参与3′端修剪的因子还不清楚。成熟piRNA的长度也会在这个时候确定，主要是依据PIWI蛋白的大小而定，其 3′端会由Hen1/Pimet催化产生2′-O-甲基化，3′端2′-O-甲基化修饰可以保持piRNA在体内的稳定性。在piRNA产生过程中，仅特定的PIWI蛋白会与piRNA前体相结合，如在果蝇中存在三种PIWI蛋白，但是仅仅Augergine（Aub）和Piwi与pri-piRNA作用，Ago3不参与其中。在小鼠三种PIWI蛋白中，MIWI和MILI与pri-piRNA作用，MIWI2则与次级piRNA作用。对于PIWI蛋白的选择机制尚不明确。

初级piRNA进入扩增系统增强piRNA在生殖细胞中的高表达，这个系统称为扩增环（amplification loop）或乒乓循环（ping-pong cycle）。在这个系统中，与初级piRNA相结合的PIWI蛋白，果蝇中的Aub和小鼠中的MILI，通过其内切酶活性剪切靶目标RNA。这个过程产生了次级piRNA的5′端。在果蝇中，母性遗传的piRNA也能如同初级piRNA那样激发乒乓循环，剪切产物被转移到PIWI蛋白中其他成员并修剪piRNA的3′端最终形成成熟的piRNA，与次级piRNA结合的Ago3剪切靶分子产生与Aub相互作用的次级piRNA，从而形成了由Aub和Ago3构成的异型乒乓循环。由于Piwi一旦与初级piRNA结合后就会转位至核内，所以Piwi不会参与到次级piRNA产生的循环之中。与果蝇中Piwi蛋白类似，小鼠中的MIWI2一旦与初级piRNA结合后就会转位至核内，所以MIWI2不会参与到次级piRNA产生的乒乓循环之中，MIWI2-piRNA途径也因此被称为单向次级piRNA生成途径。尽管有证据显示MILI-piRNA复合物参与到小鼠睾丸中的异型乒乓循环，但是MIWI主要与减数分裂粗线期piRNA相关，几乎不参与到扩增环途径。基于以上事实，乒乓循环不存在于小鼠之中。尽管在小鼠和果蝇中乒乓循环的细节存在不同之处，但在两个物种之中次级piRNA都会由Hen1/Pimet催化产生2′-O-甲基化（图3-2）。

A.转座子沉默：在果蝇中，大多数piRNA定位于转座子和其他重复元件中，piRNA的突变导致大量转座子的过量表达，因此，推测piRNA-PIWI复合物可以直接控制转座子的活性。在体外与PIWI蛋白结合的piRNA可以直接介导同源依赖的靶目标剪切，piRNA可以在转录后水平沉默转座子，更为有趣的是，很多piRNA通路中分子包括Aub和Ago3都位于类核周体Nuage中，位于蛋白编码基因内含子中的转座子能够逃避piRNA的沉默。这些结果表明piRNA介导的同源依赖剪切是发生在转录本从细胞核输出之后。因此，位于蛋白编码基因内含子中的转座子能够逃避沉默是因为piRNA的同源结构在核内已经发生了剪接。然而，一些研究结果表明piRNA可能在多个水平上发挥作用。PIWI家族蛋白Piwi位于细胞核内，与异染色质组装相关蛋白HP1结合，在体细胞的异染色质组装中发挥作用。piRNA产生过程中，推测解螺旋酶 spn- E的突变可以降低HP1与端粒特定转座子 TART的结合。这些结果表明与Piwi结合的piRNA可以指导异染色质的组装，进而发挥转录水平的沉默。与上述推测相一致，在小鼠睾丸中piRNA的突变可以降低DNA的甲基化程度。此外，piRNA还被发现存在于多聚核糖体成分中，而且小鼠的Piwi蛋白Mili与翻译起始因子相关联，所以piRNA可能参与到调控翻译过程。

B.控制基因的表达：在多个物种中，包括海绵动物、刺胞动物、秀丽隐杆线虫和小鼠中，大部分的piRNA位于基因组中的非注释区域，仅仅很少的一部分位于转座子和其他重复片段区域。果蝇piRNA还可以来源于mRNA的3′-UTR区域，这些研究结果表明piRNA可能参与基因的表达调控过程。

miRNA 是一种长约22个核苷酸的单链小分子非编码RNA。自1993年首次在秀丽隐杆线虫（ Caenorhabditis elegans）发现miRNA lin- 4以来，现已证实miRNA广泛存在于单细胞生物如单细胞绿藻莱茵衣藻（ Chlamydomonas reinhardtii）、果蝇、小鼠以及人类之中。Sanger miRBase数据库（http://www.mirbase.org/）记录表明，前体miRNA的数量已由2002年的218条上升到现在的24 521条，数量增加了近100倍，覆盖了206个物种，其中人类前体miRNA为1872条，成熟体miRNA为2578条（图3-3）。miRNA 是真核生物中最大的基因家族之一，在线虫、果蝇和哺乳动物中占整个基因组的1%～2%。通过计算生物学的方法预测，约有60%的蛋白编码基因受到miRNA的调控。已有的研究表明，miRNA在生物体的调节过程中发挥着关键性作用，参与细胞的增殖、分化以及凋亡过程。miRNA的异常则会导致多种疾病的发生，如自身免疫性疾病、肿瘤以及心血管疾病等。

miRNA基因经Ⅱ型RNA聚合酶驱动转录生成具有发卡结构的初级转录RNA（primary miRNAs，pri-miRNAs），具有5′甲基化帽和3′polyA尾巴，长几千个核苷酸。Ⅲ型核糖核酸酶Drosha在其辅助因子DGCR8（diGeorge syndrome critical region 8 homolog）协同作用下，在pri-miRNA茎环结构的颈部切割，从而形成长约70个核苷酸的具有茎环结构的前体miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA），然后由蛋白Exportin-5运送出核。在细胞质中，premiRNA经由另外一种Ⅲ型核糖核酸酶Dicer及其辅助因子TRBP（TAR RNA-binding protein 2，TARBP2）构成的复合体剪切，去除茎环结构的环部而产生长约22核苷酸的RNA双螺旋。双螺旋RNA与AGO（Argonaute）蛋白构成miRNA诱导的沉默复合物（miRNA-induced silencing complex，RISC）。随后，双螺线RNA中的一条从属链被释放并降解，而另外一条向导链则保留在RISC复合物中发挥生物学作用（图3-4）。

在经典的miRNA产生过程中，pri-miRNA经过核内的Drosha与细胞质中的Dicer酶所介导的两个相继的酶切反应而形成成熟的miRNA，但有一些miRNAs如内含子miRNA以非Drosha或Dicer依赖的过程产生miRNA。内含子miRNA含有供体和受体剪切位点，通过剪切作用形成内含子套索进而形成pre-miRNA，即pre-miRNA不是由Drosha酶剪切形成的。

lncRNA是指长度大于200个核苷酸的非编码RNA转录本。2002年Okazaki等首次对lncRNA进行了定义，他们在小鼠全长cDNA文库的大规模测序中，鉴定了大量较长的非编码RNA转录本。lncRNA转录水平低于蛋白编码基因，具有组织特异性，即可以参与表观遗传、可变剪切和入核转运等过程，在调节生长发育、细胞定向分化、亚细胞结构分布、进化选择和人类疾病的关系等方面有重要作用。到目前为止，已发现的大多数lncRNA由RNA聚合酶Ⅱ进行转录。这类转录物不具备蛋白质编码能力，但它们具有与mRNA相似的生物学特性，如5′端帽结构、剪接模式以及多聚腺苷酸尾。根据长链非编码RNA相对于附近蛋白编码基因的位置，可以分为四类：①反义lncRNA；②内含子lncRNA；③双向非编码RNA；④基因间lncRNA。

miRNA在物种进化过程中具有较高的序列保守型，在人和小鼠中miRNA的序列相似性超过90%。与之相比，lncRNA具有较低的序列保守型，在小鼠和人中低于70%，比基因的5′或3′非翻译区还要略低一些，与蛋白质编码基因的内含子区域类似。然而，研究结果显示，较低的序列保守性并未影响lncRNA功能上的保守性，这可能是因为lncRNA内部包含有若干较短的高度保守区域，这些区域可能会和某种特定的蛋白因子发生相互作用，或者形成某种特定的二级结构而发挥其共同的生物学功能。

研究表明，lncRNA以顺式作用或反式作用的方式广泛参与诸如剂量补偿、细胞分裂及细胞分化等生物学过程。通过调节组蛋白修饰、染色质重塑、蛋白质功能活性等，lncRNA可在表观遗传水平、转录水平和转录后水平进行对基因进行顺式或反式调控，从而广泛地参与包括细胞分化、个体发育在内的重要生命过程，其异常表达还与多种人类重大疾病的发生密切相关。

A.染色质修饰：lncRNA可通过募集染色质重塑复合物至特定基因组位点从而实现表观遗传调控。同源异型框基因反义RNA（hox transcript antisense RNA，HOTAIR）转录自同源异型框基因C（homeobox C，HOXC）位点，通过募集polycomb染色质重塑复合物PRC2，反式抑制HOXD的转录。HOTAIR的作用方式类似于支架，它的5′端结合PRC2蛋白家族，可介导H3K27的三甲基化，而它的3′端结合赖氨酸特异性去甲基化酶1（lysine specific demethylase 1，LSD1）等，使H3K4me2/3去甲基化，从而反式调控多种基因的表达。

X染色体失活过程是指雌性哺乳动物中的两条X染色体中的一条随机失活，以达到雄性和雌性中表达等量的X关联基因。在雌性哺乳动物中，X失活中心（X inactivation center，Xic）控制着2条X染色体中的一条染色体沉默，从而维持剂量补偿效应。Xic是通过两个lncRNA，即X染色体特异性失活转录物（X-inactive specific transcript，Xist）和Xist的反义转录物（X inactive specific antisense transcript，Tsix）实现X染色体失活的。Xist的表达只来源于失活的X染色体，Xist基因的5′端编码一种称为重复A（repeat A， RepA）的lncRNA，可与PRC2形成复合体从而激活Xist的表达。Xist通过结合PRC2复合物，以催化形成H3K27me3，并使PRC2复合物作用于X染色体，改变染色体状态，从而抑制基因的转录。Xist的活性则受到其反义转录物Tsix的调控，Tsix能够有效阻断Xist的积累。

B.转录水平的调控：基因转录是一个受到严格调控的生物学过程。除了RN聚合酶Ⅱ、通用转录因子和基因特异性转录因子，研究结果表明lncRNA也参与到了基因的转录调控之中。lncRNAs可以通过多种机制调节RNA聚合酶Ⅱ的活性，包括通过干扰起始复合物的形成，影响启动子的选择。Martianov等研究结果显示，人类DHFR基因的上游次级启动子可转录产生lncRNA，该lncRNA可以和DHFR的主要启动子区域形成RNA-DNA三联体，进而阻止转录因子辅助因子TFⅡD与启动子结合，从而阻断DHFR的表达。

lncRNA的转录可以调节邻近基因的表达。Wang等证实近端启动子转录的lncRNA可将RNA结合蛋白定位至基因启动子区域从而调控基因的表达。DNA损伤可诱导细胞周期蛋白D1（CCND1）上游lncRNA的表达，该lncRNA可以募集RNA结合蛋白TLS进而抑制CCND1的表达。

C.转录后水平调控：lncRNA除了可以在转录水平上调控基因表达外，还参与到基因转录后水平的调控。定位于细胞核内的lncRNA可参与RNA剪接及细胞质输出等过程，定位于胞质的lncRNA则可参与到维持RNA稳定性、翻译调控等过程。

肺癌转移相关转录物1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是一种由初级转录物的3′端加工而来的lncRNA，在多种癌症中异常表达。Tripathi等发现MALAT1可以与丝氨酸/精氨酸剪接因子（ser/arginie splicing factor，SR）相互作用，并影响其在核斑区的分布，进而对mRNA的选择性剪接进行调控。ANA/BTG3蛋白是一种抗增殖蛋白，在前列腺和肺癌中表达显著性下调。Yanagida等发现ANA/BTG3的反义转录物ASBEL可以对其产生负调节作用，而且证实ASBEL是通过与ANA/BTG3 mRNA形成双链结构影响了其胞质输出，从而实现了对其的抑制作用。β-分泌酶1反义转录物（BACE1-antisense transcript，BACE1-AS）是β-分泌酶1（β-secretase-1，BACE1）基因的天然反义转录物。Faghihi等发现BACE1-AS可与BACE1 mRNA作用从而增加其稳定性，进而增加了BACE1蛋白的表达量。

无效突变实验揭示 lin- 4是线虫时序发育的关键基因，在幼虫L1向L2的转换中发挥重要作用。 lin- 4基因的缺失可导致线虫在幼虫晚期反复出现幼虫L1期的特征，结果使线虫的成熟结构缺失和排卵障碍。1987年，Ferguson等发现 lin- 14基因的突变可以逆转 lin- 4无效突变所产生的异常表型。 lin- 4和 lin- 14间的相反作用提示 lin- 4有可能对 lin- 14起到负调控的作用。然而，Ambros等发现 lin- 4基因中无起始和终止密码子的存在，而且在推测的编码框中引入突变对 lin- 4功能并不产生影响。经试验证实 lin- 4是非蛋白编码基因，其编码产物是约60bp的前体和21bp的成熟体。Ambros和Ruvnkun实验室分别发现 lin- 4可通过与 lin- 14的3′-UTR互补，进而对 lin- 14的表达进行调控，并于1993年发表于 Cell杂志的同一期中。这一重大发现揭示了生命体内源性小非编码RNA对基因表达的调控，为生命调控网络增添了新的成员。

2000年，在 lin- 4基因被发现7年后，Reinhart等发现了第二个miRNA： let- 7。 let- 7基因是长约21bp的小分子非编码RNA，是秀丽隐杆线虫的另外一个异时性基因，控制着线虫幼虫L4向成虫的转变。 let- 7基因功能的缺失线虫在成体发育阶段出现幼虫的特征，而 let- 7基因的过表达则促使幼虫的早熟。 let- 7基因的这种调控作用则是通过与 lin- 41基因的3′UTR相互作用而实现的。进化上的保守型分析显示 let- 7基因序列在果蝇和人中高度保守，这提示小分子RNA包括 lin- 4和 let- 7不仅仅是发育过程中的个别现象，而有可能是生命活动中的一个重要调节机制。这一重大发现极大地促进了一个新的学科的产生和发展：小分子非编码RNA-miRNA。

miRNA的发现引发了科学家们对miRNA发生的研究兴趣，2001年，Grishok等发现Dicer酶对于 lin- 4和 let- 7的活性是必需的，与此同时，Hutvagner等证实 let- 7 pre-miRNA被Dicer酶所剪切。Dicer酶属于Ⅲ型RNaseⅢ，在裂殖酵母、植物和动物中具有保守性。RNaseⅢ是一种双链RNA特异性的核糖核酸酶内切酶，依据其结构域的构成分为三类。Ⅰ型RNaseⅢ包含一个保守的RNaseⅢ结构域和双链RNA结合结构域（dsRBD），主要存在于细菌和酵母之中。Ⅱ型RNaseⅢ包括Drosha及其类似物，主要由两个串联的RNaseⅢ结构域、一个dsRBD结构域以及N末端功能未知结构域构成，Drosha类似物仅存在于动物体内。Dicer是Ⅲ型RNaseⅢ，由两个RNaseⅢ结构域，一个dsRBD结构域以及PAZ结构域和推测的解螺旋酶结构域。Dicer是一个胞质蛋白，在miRNA的产生过程中负责miRNA的成熟剪切。在miRNA的产生过程中，pri-miRNA经初级剪切产生70bp的前体pre-miRNA，这个过程发生在核内。2003年Lee等发现细胞核内的miRNA初级成熟过程是由Drosha酶介导的，Drosha酶位于细胞核内，参与核糖体RNA前体pre-rRNA的处理过程。2004年，Gregory等则进一步揭示DGCR8 与Drosha 共同构成了微处理复合体，负责miRNA的初级成熟过程。miRNA的发生涉及一系列的先后加工过程，分别发生在细胞核与细胞质之中，在核内由Drosha产生的pre-miRNA经核胞质转运蛋白转移至细胞质进行进一步的加工。Yi等和Lund等分别于2003年12月和2004年1月证实负责pre-miRNA转运的核胞质转运蛋白是Exportin-5。

miRNA作为生命活动中重要的调节分子，其异常可能导致机体功能的紊乱。慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）是西方国家成年人中最常见的白血病类型。13q14缺失是CLL种最常见的染色体异常形式，约占病例中的50%。2002年Calin等发现miR-15和miR-16存在于13q14区域，13q14缺失导致miR-15和miR-16表达的下调，这也是首次关于miRNA与癌症的报道，同时也是最早的关于miRNA与人类疾病关系的报道。2006年Van Rooij等发现在人和小鼠心肌肥厚与心衰组织中至少12 个miRNA异常表达，而且当在小鼠体内过表达miR-195时产生了病理性的心脏生长及心衰。

随着miRNA不断被发现和数量的增加，miRNA的功能研究迫在眉睫。基于敲低或敲除的功能缺失性研究和基于过表达的功能获得性研究是基因功能研究的经典模式。2005年Krutzfeldt等构建了与miRNA互补的修饰核苷酸：2-O-甲基寡核苷酸，命名为antagomirs，并利用antagomirs通过静脉注射的方式实现了小鼠在体肝脏、肺、肾脏和心脏等12组织中miR-16、miR-122、miR-192和miR-194等的特异性敲低。2007年Ebert等建立了miRNA的特异性竞争抑制物——miRNA sponge，miRNA sponge是通过将与miRNA互补的多个重复核苷酸片段构建入载体所形成的，其中相对于miRNA第9～12位核苷酸位点存在错配，避免内源性Ago2的剪切从而提高其稳定性。Sponge 通过碱基配对的方式吸附特定的miRNA从而达到抑制其功能的作用。锁核酸（locked nucleic acid，LNA）是一种经过修饰的RNA，结构中β-D-呋喃核糖的2′-O，4′-C位通过缩水作用形成刚性的结构，由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。2011年Obad等构建了针对miRNA 种子区域8个碱基的LNA，并实现了体内长时效的miRNA沉默。这一技术不仅成为探讨miRNA功能的有效工具，也使miRNA相关疾病的治疗成为可能。2008年Santaris设计的全球首个miRNA药物SPC3649（LNA-antimi RTM-122）进入Ⅰ期临床试验。

在人类基因组中，miRNA基因存在于除Y染色体外的所有其他染色体，以单拷贝、多拷贝或基因簇等形式存在。依据miRNA在基因组中的位置不同，miRNA基因可以分为三类：基因间miRNA、内含子miRNA以及外显子miRNA。

基因间miRNA不依附其他基因，以单顺反子或多顺反子的形式存在。基因间miRNA拥有自己的启动子和其他调节元件。基因间miRNA主要由Ⅱ型RNA聚合酶驱动转录过程，因此含有Ⅱ型RNA聚合酶转录产物的特点，其最初产物为大的具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴（AAAAA）的pri-miRNA。已有研究结果和生物信息学算法结果显示，基因间miRNA有确定的转录起始位点和polyA信号序列，最初转录产物长度为3～4kb。

内含子miRNA位于基因的内含子之中，以单个miRNA或miRNA簇的形式存在。在已知的miRNA中，约有1/3的miRNA位于蛋白编码基因的内含子中。内含子miRNA与其宿主基因使用共同的启动子，因而常常与宿主基因具有类似的表达丰度。而且有些内含子miRNA与其宿主基因蛋白协同作用调控相同的生物学过程，如miR-33家族可与宿主基因编码蛋白固醇结合元件结合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP）协同作用，减少胆固醇的流出和增加胆固醇的生物合成。然而有一些内含子miRNA拥有自己的启动子，如miR-17-92基因簇，它位于C13orf25基因的第三内含子中。一些内含子miRNA在多个物种中高度保守，这说明他们在生命过程中占有重要的地位。在内含子miRNA中，有一些miRNA的pre-miRNA序列为整个内含子序列，在pre-miRNA序列的两侧存在剪切位点，这类 miRNA被称为mirtron。

外显子miRNA是三种miRNA基因中含量最少的一种，它位于非编码基因中的外显子和内含子的重叠区域。外显子miRNA和宿主基因由相同的启动子驱动转录。

miRNA的主要生理功能是调节生物体中基因的表达。在哺乳动物中，据推测miRNA可以调节60%的蛋白编码基因以及参与众多的细胞过程，如增殖、凋亡和分化。在动物体内，miRNA可通过两种方式调节基因的表达：蛋白翻译的抑制和蛋白翻译的激活，其中蛋白翻译的抑制是其重要的调节方式，又存在三种不同的形式：①miRNA抑制翻译的起始；②翻译起始后的抑制；③miRNA介导的mRNA去腺苷酸化及其降解。

缺少功能性5′甲基化帽或者其翻译不依赖于5′甲基化帽的mRNA可以避免miRNA的表达抑制。在转染的HeLa细胞中，由内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）所介导的病毒HCV和EMCV 的mRNA翻译是不受miRNA翻译抑制作用所调控的。基于以上研究，我们可知miRNA沉默复合物有可能是通过与真核起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E）或者eIF4E募集复合物相互作用而起到翻译抑制作用的。eIF4E是一种真核转录起始因子，它能够识别5′甲基化帽结构，因此miRNA介导的翻译抑制作用有可能是干扰了翻译起始中的甲基化帽识别过程。miRNA对mRNA翻译起始的抑制还可以通过抑制核糖体复合物的形成而实现。在果蝇中，miR-2可以抑制40S核糖体亚基的募集以及80S起始复合物的形成。此外，miRNA可以阻止60S和40S的结合进而抑制翻译的起始。

除了可以抑制翻译的起始外，众多的研究表明miRNA的抑制也可以发生在起始后的过程中。在动植物组织中，miRNA和AGO蛋白与多聚核糖体成分偶联，这为miRNA可以抑制翻译的延伸过程假说提供了证据。关于miRNA是如何发挥翻译起始后抑制作用的，存在多种机制。有研究表明miRNA可导致新生肽链在翻译的同时降解，也有研究表明miRNA可引起核糖体从mRNA上脱落。miRNA沉默复合物究竟是如何抑制mRNA翻译中的延伸过程的还需要进一步的研究。

在早期的研究中，人们一直认为在动物体内miRNA是通过抑制mRNA的翻译而不改变mRNA的表达水平。但在随后的研究中这一认识被推翻，研究结果发现miRNA介导的靶基因mRNA的降解也是翻译抑制的重要机制。尽管当miRNA与靶基因mRNA 3′-UTR完全匹配时，它能够直接降解mRNA，而不完全匹配时miRNA不能介导mRNA的直接降解，但是在不完全匹配的情况下，miRNA沉默复合物能够通过脱腺苷化即随后的mRNA脱甲基化帽方式将mRNA引入细胞的降解过程。

polyA尾巴和polyA结合蛋白[poly（A）-binding protein，PABP]能够通过与eIF4F复合物中的eIF4G相互作用而增强5′甲基化帽依赖的mRNA翻译。研究结果表明5′甲基化帽和poly（A）尾巴是miRNA抑制作用中的必要成分。近期研究发现PABP可通过GW182与miRNA复合物相互作用，这对于miRNA介导的mRNA沉默是至关重要的。miRNA沉默复合物与PABP是脱腺苷酸酶介导靶基因mRNA脱腺苷酸化过程中的关键性成分。然而，miRNA是如何招募脱腺苷酸酶复合物以及poly（A）是如何脱腺苷酸的机制还不清楚。mRNA脱腺苷酸后由DCP1/DCP2脱帽酶复合物作用去除5′甲基化帽，最终被细胞质内主要的5′-3′核酸内切酶XRN1所降解。

miRNA不仅能够抑制mRNA的翻译，而且在特定的环境下它还能够激活翻译过程。在最近的研究中发现一些miRNA能够激活mRNA的翻译。有些miRNA在增殖细胞中能够抑制mRNA的翻译，而在静态细胞中（G0/G1）中则可以上调基因的表达。例如，在血清饥饿状态下，与肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）3′-UTR结合的AGO2-miR369-3复合物能够招募脆性X相关蛋白1（fragile X-related protein1，FXR1）从而刺激TNF-α的翻译。在应急或者营养匮乏条件下，miR-10a能够与许多核糖体蛋白mRNA的5′UTR相互作用增加它们的翻译。

近年来，研究者已经建立了多种不同的方法用于鉴别miRNA的靶基因，包括经典遗传学方法、计算生物学预测以及高通量生化方法。

经典遗传学方法是通过表型校正实验来鉴定miRNA靶位点的，靶基因能够弥补相应miRNA缺失后所产生的表型变化。例如 lin- 41基因的突变可以弥补 let- 7基因突变体所导致的表型变化，这表明 lin- 41是miRNA let- 7的靶基因。miRNA的突变体可以通过传统的突变方法或者RNAi而产生。在miRNA突变体模型中，其靶基因往往是上调的，因此将靶基因突变或者敲低后能够部分或者全部弥补由miRNA突变所发生的表型变化。经典遗传学方法的优势在于通过这种方法鉴定出的miRNA靶基因是在生理条件下的相关基因。但它的不足之处在于无法区分miRNA与靶基因是直接相互作用还是间接作用，而且当miRNA存在多个靶基因的时候，通过这种方法比较难以实施。此外，经典遗传学方法还比较耗时，不适于大规模的筛选工作。

计算生物学方法是基于不同规则的算法来预测miRNA的靶基因。尽管各种预测软件的原理存在不同之处，但是为了提高准确性，降低假阳性率，绝大多数算法会建立在已证实的miRNA及靶基因序列间相互作用的基本规律之上。目前常用的在线免费预测软件如表3-4所示。

与生物信息学相结合的生物化学方法在识别靶基因的灵敏度、内源性mRNA靶位点以及大规模筛选等方面有着很大优势。在早期的实验中，利用免疫沉淀的方法将miRNA核糖体蛋白复合物沉淀，然后分离相关mRNA，最后采用芯片进行分析。近来，紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing，CLIP-seq）的产生大大促进了miRNA靶基因的鉴定工作。CLIP-seq是结合紫外交联免疫共沉淀和高通量测序的技术，可在全基因组水平揭示RNA分子与RNA结合蛋白相互作用。其主要原理是通过紫外交联将RNA分子与RNA结合蛋白进行固定，然后再以RNA结合蛋白的特异性抗体将RNA-蛋白质复合体进行沉淀并回收其中的RNA片段，经添加接头、RT-PCR和文库构建等步骤，对这些分子进行高通量测序，再经生物信息学的分析和处理、总结，挖掘出其特定规律，从而深入揭示miRNA的靶基因。

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性进行性的自身免疫性疾病，以关节滑膜炎及对称性、破坏性的关节病为主要特征。由T淋巴细胞、B淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞以及滑膜成纤维样细胞等产生的炎性细胞因子在类风湿关节炎的发病中发挥着重要作用。miRNA作为重要的细胞调节因子，越来越多的研究表明miRNA在类风湿关节炎的发生中发挥一定的作用。

在类风湿关节炎患者不同类型的细胞中，有多种miRNA的表达出现异常，如miR-146a，miR-203和miR-124a等。2008年Stanczyk等报道miRNA芯片分析的结果显示与骨关节炎患者相比，miR-155与miR-146a在类风湿关节炎患者滑膜组织和滑膜成纤维细胞中的表达显著性上调。过表达的miR-155可以对基质金属蛋白1（matrix metalloproteinase 1，MMP-1）和基质金属蛋白3（matrix metalloproteinase3，MMP-3）起到负调控作用，有可能介导了类风湿关节炎滑膜成纤维细胞在类风湿关节炎发生中的破坏作用。同年，Pauley等发现在类风湿关节炎患者外周血单核细胞中miR-155、miR-146a、miR132和miR-16的表达显著性增加，而且结果表明miR-146a与TNF-α的产生相关。2009年Nakamachi等的研究结果显示类风湿关节炎患者滑膜细胞中miR-124a显著性下调。miR-124a在细胞增殖过程中发挥作用，在类风湿关节炎滑膜细胞中转染miR-124a前体能够抑制细胞增殖，将细胞阻滞在G1期。进一步研究揭示miR-124a可以靶向调控周期蛋白依赖激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK-2）和单核细胞趋化因子1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），而CDK-2和MCP-1参与炎症过程。2010年Fulci等发现miR-223在类风湿关节炎患者CD4 ⁺淋巴细胞中高表达，由于T淋巴细胞在类风湿关节炎的发病中发挥重要作用，因此miR-223有可能通过调节T细胞反应而在疾病的起始阶段发挥作用。2011年Kurowska-Stolarska等发现在类风湿关节炎患者的滑膜和CD14 ⁺与CD68 ⁺细胞中miR-155表达显著性上调，miR-155能够下调SHIP（Src homology 2-containing inositol phosphatase-1，SHIP-1）的表达，而SHIP是炎症的抑制因子。在CD14 ⁺中高表达miR-155能够增加促炎症因子的生成，相反抑制miR-155的表达则能够降低TNF-α的生成。

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种多系统免疫紊乱性疾病，以关节炎、脉管炎、血细胞减少、浆膜炎以及肾小球炎为临床特征。狼疮性肾炎是系统性红斑狼疮严重的并发症，存在很高的死亡率。目前，SLE的治疗药物包括环磷酰胺、硫唑嘌呤、麦考酚酸莫酯以及糖皮质激素类。尽管存在这些疗法，但是还存在30%的患者会发展为末期肾脏疾病。因此探讨SLE发病的细胞分子机制，对于SLE的治疗至关重要。miRNA在SLE中的作用逐渐得到关注，如miR-21、miR-25、miR-125a等。2007年，Dai等的研究结果表明在SLE患者的外周血单核细胞中16个miRNA发生了显著性的变化。2009年，Tang等研究发现在SLE患者的外周血单核细胞中有42个miRNA的表达发生了显著性的变化，与对照组相比其表达量降低了6倍。其中miR-146a是Ⅰ型干扰素和TLR7信号通路的负调控因子，在先天性免疫系统细胞中可以靶向调控STAT1和IRF-5，同时它还可影响T淋巴细胞。2010年，Pan等通过高通量miRNA分析发现miR-21和miR-148a在SLE患者和模型小鼠CD4 ⁺ T细胞中高表达，通过抑制DNA甲基化转移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）促进细胞的低甲基化，从而使自身免疫相关甲基化敏感基因，如CD70和LFA-1过表达。进一步的研究发现，在SLE T细胞中高表达的miR-21可以直接抑制Ras-MAPK信号通路中DNMT1上游信号分子RASGRP1。miR-148a则通过直接靶向DNMT1的编码区而抑制其表达，加速细胞内低甲基化状态，诱导自身免疫相关甲基化敏感基因启动子区域去甲基化，上调敏感基因的表达，介导疾病的发生。

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种常见的中枢神经系统脱髓鞘病变，多发于20～40岁的中青年。MS能够影响脑和脊髓，免疫反应和炎症可导致髓鞘损伤，从而延缓或者终止神经冲动的传递。TH-17细胞是一类分泌细胞白介素-17（interleukin 17，IL-17）的CD4 ⁺T淋巴细胞，分化成熟的TH-17细胞可以分泌IL-17和IL-22等多种细胞因子，研究结果表明TH-17细胞与自身性免疫性疾病如多发性硬化、类风湿关节炎和系统性红斑狼疮等。2009年Du等发现复发缓解型MS（relapsing-remitting MS，RRMS）患者外周血白细胞中miR-326显著性升高，加速了RRMS患者TH-17细胞的分化。miR-326是通过靶向调节TH-17分化负调控因子Ets-1而促进TH-17细胞分化的。2010年，Lindberg等首次对比了健康人和复发缓解型RRMS患者CD4，CD8和B细胞中365个miRNA的表达情况，研究结果发现miR-17-5p在MS患者外周血CD4淋巴细胞中显著性上调。2013年Gandhi等对比了RRMS、继发-进展型多发性硬化（secondary progressive MS，SPMS）和健康人血浆中的368个miRNA，研究结果表明miRNA可以作为一种有效的生物标记分子来检测MS的发生。

神经退行性疾病（neurodegenerative disease，ND）是一类慢性进行性神经疾病，以神经元功能和结构的进行性丧失为特征，最终导致神经系统神经元的死亡。依据所累及神经元的不同，存在多种不同类型的神经退行性疾病，最常见的如：阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、亨廷顿舞蹈症（Huntington’s disease，HD）和肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）。这类疾病不单纯是单基因疾病或者多基因疾病，由于在疾病的发生中存在多种因素，使得神经退行性疾病的病因更加复杂。最新的研究结果表明miRNA表达的异常有可能是ND的发病原因之一，它可以对大多数参与ND发生的机制产生影响。一种miRNA可以调节多个靶基因，这使得通过调节单个miRNA就可以对整个疾病产生影响成为可能，同时miRNA也可能成为一种治疗ND的新的药物靶点。

1817年James Parkinson首次报道了帕金森病（Parkinson’s disease，PD），在神经退行性疾病中发病率位于第二，在年龄高于60岁的人群中发病率约为1%，影响全球4 100 000～4 600 000的人口。研究结果表明多巴胺神经元选择性进展性丧失导致黑质色素脱失可能是PD发生的原因。2007年Kim等探讨了miRNA对中脑多巴胺神经元终末分化、功能及存活的影响，结果显示miR-133b特异性地表达于中脑多巴胺神经元，而在帕金森疾病组织中丧失。进一步研究结果表明，miR-133b与成对同源异型结构域蛋白转录因子3（paired-like homeodomain transcription factor3，Pitx3）构成负反馈通路而在中脑多巴胺神经元的成熟和功能上发挥重要作用。PD发病的具体分子机制尚不明了，但研究表明有几个基因功能的异常与PD的发生相关，如 SNCA（α-synuclein）， LRRK2（leucine-rich repeat kinase 2）， parkin， PINK1（PTEN-induced putative kinase1）和 DJ- 1等。

SCNA位于突触前末梢，广泛表达于成年脑组织，特别是新皮质、海马和黑质中。SNCA突变最早发现于常染色体显性帕金森疾病，到目前为止，有三种常染色体显性突变（A53T，A30P和E46K）与家族性PD共分离。 SCNA基因拷贝数变异也可导致常染色体显性遗传早发型PD。2009年，Junn等发现主要表达于神经元的miR-7可以直接作用于SCNA抑制其表达，而且miR-7可以通过下调SCNA的表达保护细胞免受氧化应激的损害。2010年，Doxakis进一步证实了miR-7对SCNA的调节作用，并发现miR-153同样对SCNA有直接的靶向作用。

LRRK2是富含亮氨酸重复激酶家族成员，在海马和纹状体中高表达，亚细胞定位主要存在于细胞质，但在线粒体外膜上也有一定的表达。LRRK2在神经元的发育过程中发挥一定的作用，其突变可导致散发级家族性PD。最新的研究结果表明突变型LRRK2之所以可以导致PD的发生，是因为LRRK2可通过与Ago1和Ago2相互作用进而降低其表达，从而削弱了miRNA对特定基因的抑制作用。Gehrke等的研究结果显示LRRK2突变减弱了miR-184*与 let- 7对E2F1和DP的抑制作用，而E2F1和DP的高表达则会诱导多巴胺神经元的死亡。

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease）是最常见的神经退行性疾病，其特征是记忆力减退和认知能力下降，随着病情恶化，广泛的神经元和突触损伤，影响着大脑皮质、海马、杏仁核和基底前脑。年龄是一个AD的主要风险因素，65岁之后，每5年发病率升高一倍。阿尔茨海默病的主要病理特征是神经原纤维缠结（neurofibrillary tangle，NFT）、β-淀粉样蛋白沉积、脑血管淀粉样变性，此外，在淀粉样沉淀周围出现严重的炎症反应和小胶质细胞活化，产生大量的对中枢神经系统有毒的成分。β-淀粉样蛋白是由淀粉样前体蛋白（amyloik precursor protein，APP）经过β位APP剪切酶1（beta-site APP-cleaving enzyme1，BACE1）和γ-分泌酶剪切形成。造成阿尔茨海默病的分子机制尚不清楚，但是临床及科研结果表明miRNA表达的异常与β-淀粉样蛋白的产生、神经原纤维缠结的形成以及神经性退化相关。体外实验研究表明有多种miRNA可直接抑制APP的表达，如miR-106、miR-520c、miR-16和miR-153等。Hebert等发现miR-9、miR-29a与miR-29b-1可抑制BACE1的表达，并证实了miRNA的异常表达与AD相关。随后的研究又发现在AD动物模型中其他miRNA，如miR-298、miR-328与miR-195对BACE1的抑制作用。

IGF-1在脑组织中的作用包括β-淀粉样蛋白的清除和tau蛋白的磷酸化。据文献报道IGF-1信号通路的异常与AD相关。Hu等的研究结果表明在小鼠AD模型中miR-98与IGF-1的表达呈负相关，进一步的研究显示在AD细胞模型中高表达miR-98可以下调IGF-1的表达，从而增加了β-淀粉样蛋白的产生及tau蛋白的磷酸化。

丝氨酸棕榈基转移酶（serine palmitoyltransferase，SPT）是神经酰胺从头合成的第一限速酶，由丝氨酸棕榈基转移酶长链1（serine palmitoyltransferase long chain1，SPTLC1）和丝氨酸棕榈基转移酶长链2（serine palmitoyltransferase long chain2，SPTLC2）两个亚基构成。膜神经酰胺可通过将BACE1和γ-分泌酶错定位于脂筏上而增加了β-淀粉样蛋白形成，从而在AD的发生中发挥作用。在散发AD患者中，SPT与miR-137、miR-181c、miR-9、miR-29b-1、miR-15等的表达呈现相同的增加趋势，并证实miR-181，miR-137可以直接靶向SPTLC1，miR-29a、miR-29b1和miR-9则靶向SPTLC2。

微管相关蛋白tau可以促进微管的组装和稳定，它的异常涉及多种神经退行性疾病，统称为tau蛋白病（tauopathies）。在AD中，tau发生超磷酸化并在细胞质中聚集形成神经元内蛋白聚集物，称为NFT。Dickson等发现miR-34a可以直接抑制人tau的表达。Absalon等揭示在AD的早期阶段miR-26b在黒质中开始增高，而且随着病程的进展在人AD脑中的表达仍然很高。经证实Retinoblastoma（Rb）是miR-26b的靶目标，而且在皮质神经元中高表达miR-26b和降低Rb的表达均可以激活周期依赖蛋白激酶5（cyclin-dependent kinase5，Cdk5）和增加tau的磷酸化水平，并导致神经元的凋亡和退化。

亨廷顿舞蹈症（Huntington’s disease，HD）是一种到目前为止仍无法治愈的神经退行性疾病，是由Huntingtin（ Htt）基因中CAG重复的过度扩增导致的。由于皮质神经元和纹状体神经元进行性丧失导致神经元功能紊乱，HD患者表现为认知缺陷和运动障碍。突变后的Htt蛋白丧失了对神经元的保护性，反而对细胞产生毒性从而导致神经元的死亡。关于Htt蛋白的具体作用机制尚不明了，但是突变体Htt可以影响细胞表型和活力。在HD患者的脑组织中，多种基因的表达发生了改变，而且脑组织中与野生型Htt蛋白相互作用的多种转录因子则与突变型Htt发生了共聚集，从而失去了正常的调节功能。更重要的是，Htt突变体可通过与Ago1和Ago2蛋白相互作用阻止P-body复合体（processing bodies）的形成，进而对miRNA功能的发挥产生影响。因此在HD患者脑组织中，多种miRNA出现了紊乱。

Htt蛋白可与抑制因子1沉默转录因子（repressor element 1 silencing transcription factor，REST）相互作用。REST是一种基本转录抑制因子，又称为神经元限制性沉默因子（neuronrestrictive silencing factor，NRSF）。在正常人中，Htt可在细胞质内沉默REST，避免其入核与DNA结合。但在HD患者神经元中，Htt突变体无法与REST相互作用，REST入核后抑制相关基因的表达，包括对于神经元存活必要的BDNF基因。Johnson等依据REST的结合位点，确立了一系列REST靶向的miRNA，其中miR-29a、miR-124a、miR-132和miR-330四种miRNAs在R6/2HD动物模型皮质中表达下调。进一步的研究表明在HD患者组织中，仅miR-132的表达发生了显著性的下调。Packer等通过分析Brodmann区域miRNA表达谱，探讨了miRNA与HD患者病情进程的关系。结果表明随着病程的进展，miR-9、miR-9*、miR-29b、miR-124a和miR-132五种miRNAs的变化发生了显著性变化。Cheng等发现miR-196a可能参与HD的发生，进一步的研究表明miR-196a通过抑制Htt蛋白的合成，部分由于加速了Htt蛋白的降解，而不是与其3′-UTR相互作用。

Nerfin-1（nervous fingers 1，Nerfin-1）是轴突导向的核调节因子，在果蝇中，多种miRNA可与nerfin-1的3′-UTR不同位点相互作用，从而在中枢神经系统和外周神经系统的发育中发挥作用。miRNA结合位点进化上的保守型提示miRNA在其他物种的神经发育中同样会发挥重要作用。研究结果也表明miRNA的调节作用在动物神经发育的多个阶段如神经发生和突出发生中均发挥重要作用。 HOX基因簇中miRNA的发现是miRNA在神经系统发育中发挥作用的有力证据。 HOX基因家族是脊椎动物神经管前后极性和分节特征的主控基因。哺乳动物 HOX基因家族包含39个同源异型结构域转录因子；以4个基因簇（A、B、C和D）的形式存在于基因组中，每个 HOX基因簇包含9～11个基因。Garzon等发现miR-10a可以直接靶向 HOXA1。miR-196由 HOXA、 B和 C基因簇的同源位点编码，它可以直接对 HOXB8发挥剪切作用，降低 HOXC8、 HOXD8和 HOXA7的表达。

中枢神经系统富含大量的miRNA，而且这些miRNA的表达具有时间和空间特异性，这意味着在神经系统发育的不同阶段miRNA发挥着不同的生物学作用。miRNA表达谱分析揭示miR-9、miR-124、miR-124a、miR-125b、miR-127、miR-128、miR-132、miR-219以及 let- 7家族在小鼠脑组织中特异性表达，而其他63种miRNA则广泛表达。

miRNA能够在合适的位置和特定的时间决定神经细胞的命运。对小鼠脑发育过程中104个miRNAs的分析结果显示，miRNA具有特定的时间表达模式，其中12个miRNAs在胚胎阶段显著性上调，而在脑发育过程中则发生了显著性下调，计算生物学分析表明在其中10个miRNAs是与神经发生相关的。

miR-124在处于发育状态及成年神经元系统中表达，Yu等发现在小鼠P19细胞中高表达miR-124可以促进轴突的生长，而阻断miR-124则延缓了轴突的生长及降低了乙酰化α-tubulin的表达，而且在小鼠原代皮质神经元中miR-124发挥同样的生物学功能。进一步的研究结果表明miR-124可以破坏肌动蛋白纤维和微管的稳定性，从而影响细胞骨架。此外，miR-124还可以降低Cdc42的表达及影响Rac1的亚细胞定位。Visvanathan等则发现在神经元中miR-124可以直接靶向小C末端结构域磷酸酶1（small C terminal domain phosphatase1，SCP1），SCP1在发育过程中具有抗神经元功能。在脊髓中，miR-124和SCP1的表达呈负相关。在P19细胞中，miR-124可以抑制SCP1的表达并诱导神经发生。这些研究结果表明在中枢神经系统的发育过程中，适时SCP1的下调对于神经发生至关重要，而这个过程是由miR-124介导的。Cheng等发现miR-124可以直接靶向Sox9在神经元的行程中发挥重要作用。miR-132在神经元中高表达，并可被神经营养因子所诱导。在皮质神经元中高表达miR-132可以诱导轴突的生长，这种作用是通过降低p250GAP（GTPase-activating protein，p250GAP）表达实现的。Vo等通过全基因组筛选发现miR-132是CREB（camp-response element binding protein，CREB）的靶基因，在外源营养因子的刺激下CREB介导了miR-132对神经元的促生长作用。脑特异性的miR-134位于海马神经元，当神经元受到细胞外刺激因子如脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）时，可以解除miR-134对Limk1蛋白激酶的抑制作用，从而促进突触的发育和成熟。