- 整合肝肠病学:肝肠对话
- 刘玉兰主编
- 43751字
- 2021-04-19 18:16:06
第三节 肠黏膜屏障——免疫屏障
如前所述,肠黏膜屏障包含肠道的机械屏障、免疫屏障、化学屏障和生物屏障,相比肠道的机械、化学和生物屏障等,肠道的免疫屏障对于维持肠黏膜屏障的正常功能更为重要。众所周知,肠道不仅是消化和吸收营养物质的主要场所,同时也是机体最大的免疫器官。肠道不仅要吸收人体所必需的营养物质以供生命活动,同时也要避免肠道内大量的细菌和外来病原菌等进入血液损伤机体,这就要求其能够识别所接触的抗原是食物抗原、正常菌群还是病原菌,对食物抗原产生免疫耐受,对病原菌等进行免疫监视和清除。免疫系统分为固有免疫与适应性免疫,在肠道还存在一种特殊的局部适应性免疫,即黏膜免疫系统,是一个与系统免疫不同的高度分化的免疫系统。因为黏膜所处复杂而特殊的环境,黏膜免疫具有其独特性:其免疫球蛋白以分泌型免疫球蛋白A(sIgA)为主;黏膜淋巴滤泡中的淋巴细胞具有黏膜归属性,使黏膜免疫反应局限于黏膜组织;可形成共同黏膜免疫系统。
一、 肠黏膜相关淋巴组织
黏膜免疫系统是指由与外界相通的胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道以及一些外分泌腺如乳腺、泪道等黏膜相关淋巴组织构成的一个相对独立的局部免疫系统。这些部位的黏膜与外界直接或间接相通,是机体接触抗原并反应的第一道防线,具备重要的免疫功能,免疫系统的进化很可能就是从黏膜组织开始的。肠相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue,GALT)(图2-7)是肠道黏膜免疫系统的主要组成部分,包含两种形式:一种是集聚的淋巴组织,主要包含Peyer结(Payer patch,PP结)、孤立淋巴滤泡和肠系膜淋巴结(mesenteric lymphoid node,MLN),是肠道黏膜免疫的主要诱导部位;另一种是弥散分布的淋巴组织,主要包含肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes,IELs)、黏膜固有层内淋巴细胞(lamina propria lymphocytes,LPLs)以及肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs),是肠道黏膜免疫的主要效应部位。
图2-7 肠相关淋巴组织的组成
1. 集聚的淋巴组织
(1) Peyer结:
Peyer结(PP结)是位于小肠黏膜下的淋巴集结,主要位于远端小肠的黏膜固有层内。PP结是最典型的黏膜淋巴样滤泡,其腔内面覆盖着滤泡相关上皮,在上皮下形成由滤泡相关上皮细胞、杯状细胞和微绒毛细胞构成的淋巴滤泡。在结构上依据T细胞和B细胞的分布特点,可分为:①滤泡区或B细胞区;②上皮下圆顶区;③滤泡间区或T细胞区。
滤泡区:PP结内的B细胞主要分布在靠近浆膜面的淋巴滤泡,淋巴滤泡受抗原刺激形成生发中心,内含大量增殖淋巴母细胞,多数为IgA +细胞,少数IgM +、IgD +细胞位于滤泡间区。位于PP结圆顶下的生发中心含有处于分化阶段的正在经历亲和力成熟的B细胞,并发生IgA类别转换。PP结中的大部分B细胞用于合成IgA,最终合成的IgA在黏膜表面提供适应性免疫保护。当PP结受到抗原刺激后,M细胞摄取肠腔内抗原物质,转运并递呈给下方的淋巴细胞。后者进入黏膜淋巴小结和肠系膜淋巴结内增殖分化为幼浆细胞,然后经淋巴细胞再循环途径,大部分返回消化道黏膜,并转变为浆细胞,IgA +淋巴母细胞通过淋巴和血液循环最终定位于黏膜固有层。
上皮下圆顶区:PP结表面的滤泡相关上皮与滤泡之间的区域为圆顶区,圆顶区的上皮细胞与普通吸收上皮细胞不同,其游离面没有纹状缘,只有微小的皱褶和短小的微绒毛,因而称为微皱褶细胞,又称M细胞。M细胞与邻近上皮细胞通过桥粒紧密连接形成上皮屏障,胞浆内有丰富的吞饮小泡和线粒体、少量的溶酶体,这样的结构有助于其迅速将抗原转运到基底膜侧且抗原不会降解。其基底部内陷形成巨大凹腔,内有B细胞、T细胞及少数树突状细胞和巨噬细胞等。M细胞属于特殊化的抗原识别细胞,作为肠道唯一具有通透性的细胞,其能够通过主动吞饮将肠腔中的大分子、颗粒和微生物等转运到上皮下的组织内,发挥传递信息的作用。但M细胞缺乏抗原呈递所需要的重要分子HLA-2DR,故其虽有一定的抗原处理能力,但不是真正意义上的抗原呈递细胞。
滤泡间区:滤泡间区主要是T细胞,有部分B细胞和浆细胞,PP结中的T细胞包括CD4 +和CD8 +T细胞,95%以上的T细胞表达α βTCR,一小部分表达γ δ TCR。在PP结中50%~60%的α βT细胞都是CD4 +T细胞且表型成熟,剩下的是CD8 +T细胞,包括细胞毒性T细胞前体。此处还分布着淋巴细胞进出淋巴组织的通道——毛细血管后微静脉,因为PP结没有输入淋巴管,所有的淋巴细胞都通过此区域的内皮微静脉迁移到PP结中。
由于PP结含有各种必需的免疫活性细胞,一般认为其是黏膜免疫反应的主要诱导部位。
(2) 孤立淋巴滤泡:
孤立淋巴滤泡(isolated lymphoid follicles,ILFs)分布于整个小肠,覆盖在PP结圆顶区表面,可延伸到黏膜肌层甚至黏膜下层。在结构上,其与PP结非常相似,在淋巴组织表面覆盖层上皮中有滤泡相关上皮,有B细胞和与高内皮静脉相连CD4 +为主的T细胞,还有PP结的特征性结构如含有生发中心的初级滤泡和滤泡区。目前对于其在黏膜免疫中的作用还存在争议,但推测其可能具有与PP结类似的功能。如在动物实验中摘除PP结而保留孤立性淋巴滤泡,黏膜免疫的抗原处理过程仍然可以有效进行。
(3) 富含淋巴细胞绒毛:
富含淋巴细胞绒毛(lymphocyte filled villi,LFV)中多数细胞表达CD45与Thy-1,不表达CD4、CD8、CD3及B细胞表面标志,也不表达胸腺细胞表面标志。免疫组化研究表明,LFV在表型特征上不同于胸腺、PP结、上皮内淋巴细胞及固有层淋巴细胞等,而是类似于不成熟的T细胞,提示LFV可能是T细胞产生的重要部位。目前对富含淋巴细胞绒毛研究较少,其在黏膜免疫系统中的功能还有待进一步研究。
(4) 肠系膜淋巴结:
肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes,MLNs)是一群位于肠系膜内的大淋巴结,是淋巴细胞进入血流的中间站,也是肠道内淋巴细胞的丰富来源。在结构上,有发育良好的胸腺依赖区、初级滤泡和生发中心。与PP结大致相似,随着T细胞迅速迁入,淋巴结内出现初级滤泡及生发中心。在肠黏膜免疫系统中,MLNs中所有能够产生抗体的活性细胞都具有合成IgA的潜能,而且MLNs还含有辅助T细胞,主要是Th2细胞,可诱导B细胞从IgA +B细胞分化为IgA +浆细胞,促进IgA的合成和分泌。
2. 弥散的淋巴组织
(1) 上皮内淋巴细胞:
因为强大的细胞毒作用和免疫调节功能,肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes,IELs)是肠黏膜免疫效应部位的主要淋巴细胞,其分布在肠上皮细胞间基侧膜表面,可达上皮组织深层,数量约为肠上皮细胞的1/6。在小肠中,IELs的特点如下:
1) IELs的表型:
免疫荧光技术和表型研究显示,IELs主要是CD8 +T细胞,表达能够与上皮E-钙黏素(E-cadherin)结合的整合素αEβ7,说明IELs对抗原的应答主要由MHCⅠ类分子递呈。也有少量CD4 +T细胞、NK细胞等。IELs含有α βT细胞和γ δ T细胞,其中α βT细胞在人类中更为常见,比例更高,γ δ T细胞比例约为10%~15%。γ δ T细胞不需要抗原呈递就可以针对细菌抗原作出应答,是固有免疫应答机制的一部分。肠黏膜相关淋巴组织中除了与外周免疫系统表型相同的细胞,也有大量与之不同的其他亚群。α βT细胞约50%为CD8 +α α同质二聚体,其余为CD8 +α β异质二聚体或CD4 +。IELs还表达活化T细胞的标志物,85%表达CD45RO记忆表型,30%表达IL-2Rα链,90%表达αEβ7。
2) IELs归巢:
肠上皮细胞基侧表面表达E-钙黏素,其为αEβ7的配体。TGF-β可改变淋巴细胞整合素αEβ7的表达,αEβ7主要介导淋巴细胞归巢于上皮内。
3) IELs的功能:
①溶细胞活性:组成性溶细胞活性是IELs的主要功能。此功能是宿主针对病原体入侵及上皮细胞变性所做出的快速反应机制。研究表明:α β IELs分化及功能依赖抗原刺激,而较为原始的γ δ IELs可以在缺乏抗原刺激的情况下发育,并由基因型决定溶细胞活性及产生IFN-γ的能力。CD8α α + IELs的细胞毒性是由Fas介导的,而CD8α β + IELs的溶细胞活性由Fas和穿孔素介导。②辅助活性:IELs因其可产生与Th1和Th2功能相关的细胞因子而具有调节其他淋巴细胞和上皮细胞功能的特性。如CD4 +CD8 +和CD4 -CD8 +α β IELs在上皮环境中可作为成熟T辅助细胞而发挥作用。③刺激上皮细胞更新。
(2) 固有层内淋巴细胞:
正常肠道黏膜固有层分布着大量的淋巴组织样细胞,包括淋巴细胞、浆细胞、粒细胞和巨噬细胞等,固有层内淋巴细胞(lamina propria lymphocytes,LPLs)包括B淋巴细胞、浆细胞、T淋巴细胞、DC细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞,其中T淋巴细胞和B淋巴细胞数量相当。
固有层T淋巴细胞的个体发生可能为胸腺起源,幼稚T细胞进入PP结和淋巴滤泡,与抗原相遇,之后重新进入循环,然后归巢至固有层。T淋巴细胞中65%~85%为CD4 +T细胞,CD4 +细胞多表达记忆表型及辅助-诱导表型,不表达L-选择素,其表面分布的CD3能与TCR通过盐桥形成CD3-TCR复合物,将接受的抗原信号传至细胞内,在特异性免疫应答中发挥重要作用。固有层T细胞具有典型的活化T细胞相关标志物,如α4β7 +、CD45RO +、CD25 +和HLA-DR。此外,LPLs还可调节免疫球蛋白的合成,CD4 +T细胞能够分泌多种细胞因子如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-γ等,其中IL-4可激活静止期B细胞,诱导单核细胞和巨噬细胞MHC分子的表达,在诱导局部和全身免疫应答中均起关键作用;IL-5可调节IgE的产生,增强嗜酸性粒细胞对寄生虫的杀害作用;IL-6促进IgA应答;而IL-10、IFN-γ则主要发挥抑制作用。
B细胞包括小淋巴细胞与浆细胞,浆细胞前体来自PP结,通过肠系膜淋巴结和胸导管而到黏膜固有层,可产生多种免疫球蛋白,免疫荧光法证实LPLs内浆细胞70%~90%产生IgA,18%产生IgM,剩余产生IgG、IgE和极少IgD,虽然比例小但与其他器官比较仍较为丰富,由此证实固有层内淋巴细胞在肠道体液免疫中发挥重要作用。固有层内的B细胞表达αEβ7整合素,其能够与黏膜上皮细胞表达的黏膜地址素细胞黏附分子(mucosal addressin cell adhesion molecule-1,MAdCAM-1)相互作用,因此B细胞能定位于黏膜层。
固有层作为主要的黏膜免疫应答效应部位,浆细胞分泌的大量sIgA通过与病原菌、毒素等抗原发生特异性结合,从而阻止肠道内有害病菌和毒素等渗透过肠黏膜;同时,其还可通过增强具有Fc受体细胞的吞噬功能、与补体协同作用、调节肠上皮细胞的凋亡等机制起到清除外来抗原、保护机体的作用。
(3) 肠上皮细胞:
如肠道机械屏障部分所述,肠上皮细胞分为潘氏细胞、杯状细胞、神经内分泌细胞和吸收性肠上皮细胞。潘氏细胞位于隐窝底部,产生抗菌肽,分泌可溶性介质,有助于上皮干细胞增殖;杯状细胞位于整个上皮组织表面,从近端小肠到结肠其数量逐渐增加,可产生大量高糖基化蛋白,形成保护性黏液层;神经内分泌细胞表达多种固有免疫受体用于应答微生物的刺激,可分泌激素和其他信号分子,调节消化道的多种功能;吸收性肠细胞是肠道上皮中数量最多的细胞。与寿命长达数周的潘氏细胞不同,吸收性肠细胞和杯状细胞频繁更新、分化并沿隐窝-绒毛轴迁移。一旦绒毛顶端的细胞凋亡、脱落于肠腔,则被立即清除。肠道上皮的再生能力非常强,每3~5天肠道上皮细胞完全更新一次。
肠上皮细胞位于黏膜上皮层,与上皮内淋巴细胞紧密相邻,并可通过基底膜的间隙与黏膜固有层内的免疫细胞接触,这种结构是其发挥免疫学作用的基础。首先,肠上皮细胞具有抗原识别和递呈功能,通过表达模式识别受体(PRRs)识别细菌和病毒的结构,活化核因子NF-κ B产生炎症反应;其表面表达MHC-Ⅱ类分子,可摄取肠腔中的可溶性多肽抗原,处理传递给T细胞。其次,肠上皮细胞还参与sIgA的分泌和转运。在正常情况下,肠上皮细胞不表达共刺激分子,递呈抗原到CD8 +T细胞引起免疫抑制,而感染情况下,表达共刺激分子ICAM-1,递呈抗原到CD4 +T细胞而引起免疫应答。此外,肠上皮细胞具有重要的黏膜免疫调节功能,在本章第二节有详细描述。总之,肠上皮细胞具备多种生物学功能,不仅负责肠道营养物质的消化和吸收,而且在黏膜免疫防御、免疫调节和免疫耐受等方面发挥重要作用。
通过以上内容,我们可以发现黏膜免疫系统与外周和系统特异性免疫反应存在诸多不同,有其独特性。
首先,黏膜免疫反应具有不同的淋巴细胞库。比如IELs处的T细胞表达CD3、TCRα β 或TCRγ δ分子,其中包括80%CD8 +T细胞和部分CD4 +T细胞。CD8分子以α β异质二聚体和α α同质二聚体表达,前者表达于TCRα βIELs,后者表达于TCRα β或TCRγ δ IELs,在人类10%的IELs是TCRγ δ T细胞,比例明显高于其他淋巴组织。此外,黏膜上皮内的NK细胞和NKT细胞也有所不同,NK细胞与异常IEC表达的非经典MHC分子MICA和MICB通过NKG2D相结合,NKT细胞可表达特征性T细胞抗原受体Va14/Ja281。近年来,在LPL中还发现一种受MHC关联Ⅰ分子限制的T细胞亚群,即黏膜相关不变T细胞(mucosal-associated invariant T cells,MAITs),其虽然也在胸腺内发育,但其选择性发育与一般T细胞和NKT细胞不同,不识别MHCⅠ类和MHCⅡ类分子递呈的配体,而是识别由MR1递呈的配体。具有最重要意义的是,在PP结中的B细胞区中,绝大多数B细胞为IgA +B细胞,分泌大量的sIgA产生免疫效应。其次,黏膜免疫中淋巴细胞归巢途径与分布不同。PP结内的淋巴细胞受到抗原刺激后,经肠系膜淋巴结进入胸导管,再经过血液循环重新进入到肠黏膜固有层和上皮层。在这种归巢途径不同的背后,是由淋巴细胞和黏膜表面细胞表达的不同黏附分子所决定的,与外周淋巴结和皮肤高内皮小静脉表达的主要地址素——外周淋巴结地址素和血管黏附分子1不同,PP和LP的高内皮小静脉主要表达黏膜地址素细胞黏附分子-1(mucosal addressin cell adhesion molecule-1,MAdCAM-1),肠上皮细胞表面表达E-钙黏素(E-cadherin),上述黏附分子通过与淋巴细胞表面的αEβ7结合,共同介导淋巴细胞的特异性归巢。此外,淋巴细胞表面的L-选择素也可与MAdCAM-1共同介导淋巴细胞的归巢。GALT中的初始T淋巴细胞、B淋巴细胞主要表达L-选择素以及中等水平的αEβ7,而记忆性T淋巴细胞和记忆性B淋巴细胞不表达L-选择素,主要表达αEβ7,因而初始和记忆淋巴细胞通过不同途径定居于肠黏膜。
再次,肠黏膜IELs发育方式和部位不同。IELs中大多数仍然是来自于胸腺发育的传统单阳性胸腺细胞,即CD4 +TCRα β和CD8α β +TCRα βT细胞,但是IELs内也存在部分来源于非传统胸腺的细胞,如部分双阴性表达TCRα β或TCRγ δ的CD8α αIELs细胞。此外,IELs内甚至还存在不来源于胸腺的亚群,如TCRγ δ CD8α αIELs可来源于肠道隐窝斑,能产生γ δ IELs、CD8α α和CD8α β,小鼠含有这些细胞集群,但人类肠道没有。
肠黏膜免疫系统是人体免疫系统最大最复杂的部分,肠道内环境相当复杂,抗原种类繁多,而且还需要鉴别这些抗原对机体有无危害。对于无害抗原,要保持或启动低反应性的免疫监视和免疫耐受;而对有害抗原,则需要通过GALT及时启动免疫反应进行抵抗,简单的理解是GALT中M细胞与DC细胞、巨噬细胞等进行抗原的识别、处理和递呈,上皮内淋巴细胞主要负责对病原微生物感染等进行免疫监视,有一定自然杀伤活性,固有层内淋巴细胞则主要通过Th2细胞产生细胞因子等,促进集合淋巴结中的浆细胞合成分泌sIgA,形成肠黏膜淋巴系统的局部免疫功能。总之,肠黏膜系统通过共刺激信号、黏附分子、细胞因子等形成复杂的网络系统。
二、 肠道固有免疫系统
固有免疫又称先天免疫,以非特异性方式抵御外来感染,是长期进化形成、机体与生俱来的抵抗外来病原微生物入侵、清除抗原性异物的能力,是机体抗感染的第一道防线,也是启动适应性免疫的基础,是极为重要的机体免疫系统组成部分。肠道固有免疫系统由固有免疫细胞和固有免疫分子组成。当外来致病微生物穿透机体的皮肤和黏膜屏障后,机体受到外来致病微生物等刺激,启动炎症反应,产生细胞因子等将免疫细胞募集至感染部位,继而由免疫细胞以及免疫分子等发挥免疫功能,通过直接作用和间接作用清除抗原性异物。
1. 固有免疫细胞
固有免疫细胞是固有免疫应答的主要成分,参与肠道固有免疫细胞包括肠上皮细胞、M细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、NK细胞、肥大细胞、γ δ T细胞、NKT细胞、B1细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞。
(1) 肠上皮细胞:
肠黏膜屏障是保护机体免受病原体入侵的第一道防线,肠上皮细胞是其屏障功能得以发挥的重要组成部分。肠道的发育开始于妊娠中期,由内胚层细胞形成管状。肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)形成并覆盖于管道表面。绒毛和指状突起在胎儿发育过程中丢失,绒毛发生腺体样内陷即形成隐窝。肠道隐窝的多能干细胞发育成为四种不同的肠上皮细胞,四种不同的肠上皮细胞各自发挥自己的特殊功能,形成物理、化学和生物屏障。肠道表面覆盖着一层厚厚的高度糖基化蛋白形成的黏液,其中含有肠黏膜固有免疫细胞分泌的大量抗菌和抗炎因子。潘氏细胞可分泌大量酶、免疫调节介质以及高浓度的抗微生物肽,如磷脂酶A 2、溶菌酶等。结肠上皮细胞会分泌大量高水平β-防御素。抗微生物肽可抑制肠道感染、影响微生物组成,从而发挥微生物对肠道的保护作用,但抗微生物肽对微生物的调节作用、微生物对维持上皮细胞稳态的作用以及慢性炎症对微生物组成的影响等,都需要进一步研究。对于越过黏膜屏障的病原体,肠上皮细胞通过表面表达的模式识别受体(PRRs)识别,介导相应的信号通路,从而诱导IL-1β、TNF-α、IL-6等抗菌因子产生。
(2) M细胞:
M细胞是一种特殊的上皮细胞,覆盖在PP结和其他淋巴结上。不同种属的M细胞形态上有较大差异,人类M细胞最大的特点是没有表面绒毛,取而代之的是表面的微皱(microfold)或膜质(membranous),这也是M细胞名字的由来。M细胞的发育过程贯穿于胚胎发育和出生后,同其他上皮细胞一样,来源于内胚层细胞。
M细胞是肠黏膜免疫系统的哨兵,其在黏膜表面的可及性以及其对颗粒物质的转运能力,使其成为病原体的理想切入点。M细胞可以转运多种微生物使其通过肠上皮屏障,包括细菌(如霍乱弧菌、空肠弯曲菌、结核分枝杆菌、志贺菌、沙门菌、大肠埃希菌、耶尔森菌等)、病毒(如MMTV病毒、骨髓灰质炎病毒、朊病毒、HIV病毒等)和寄生虫(如隐孢子虫等)。许多病原体把M细胞作为入侵主体、建立感染通道,如伤寒沙门菌、志贺菌等肠道病原体可直接入侵并破坏M细胞,从而感染邻近的肠细胞。而M细胞和肠黏膜屏障被病原体感染也有利于机体的一面,短期暴露于非肠道菌群的滤泡相关上皮细胞可以发生快速而显著的形态和功能变化,最显著的是M细胞数量的增加,使通过滤泡相关上皮细胞的转运能力增强。
M细胞的这种特性有助于我们设计口服疫苗和口服药物的新策略。如果将M细胞作为药物吸收和传输通道,就可以有效降低药物剂量,从而减少药物、疫苗成本;改善目前的抗原呈递系统的效率。但是关于M细胞的抗原呈递功能研究并不深入,其发挥功能的分子学和细胞学机制还不是很清楚,严重限制了这种新策略的发展。所以,关于M细胞的功能及机制有待于未来研究的进一步完善。
(3) 单核巨噬细胞:
单核细胞来源于髓系祖细胞,从骨髓迁移至外周血。在稳定状态或炎症刺激下,外周血单核细胞可以迁移至组织,包括黏膜。肠黏膜巨噬细胞是机体中数量最多的单核巨噬细胞,位于上皮固有层,在形态学上既有组织定居巨噬细胞的特征,又有单核形状和丰富的胞浆颗粒,与活跃的吞噬行为相关。人类黏膜巨噬细胞表达组织巨噬细胞标志CD68,以及通用巨噬细胞标志F4/80、CD11b和CSF-1受体CSF-1R。小鼠肠黏膜巨噬细胞的标志与人类大致相同。定植于肠道的巨噬细胞表面表达介导吞噬凋亡的受体CD36,具有极强的吞噬功能,当肠上皮捕获肠腔中的细菌,巨噬细胞不会通过炎症反应对抗微生物感染,而是通过吞噬作用清除微生物。
巨噬细胞可分为M1巨噬细胞和M2巨噬细胞,前者高表达IL-12、低表达IL-10,后者低表达IL-12、高表达IL-10。M1巨噬细胞,又称为经典活化巨噬细胞,在细胞介导的免疫反应中由IFN-γ和TNF-α介导发育形成。M1巨噬细胞表面表达诱导性一氧化氮合酶、C-C模序、趋化因子CCL15、CCL20、CXCL9和CXCL10。这类巨噬细胞通过分泌炎症细胞因子如IL-1、IL-6、IL-12和IL-23等成为宿主防御的一个组成部分,是清除细胞内微生物的主要细胞,也是慢性炎症中造成组织病理性变化的主要因素。M2巨噬细胞,又称为替代性活化巨噬细胞,是一大类巨噬细胞的总称。在固有免疫反应和适应性免疫反应过程中,IL-10和TGF-β介导使初始巨噬细胞向调节性巨噬细胞发育。这种类型的巨噬细胞表面表达精氨酸酶1、几丁质酶样蛋白,同时具有分泌细胞因子IL-10、TGF-β、PGE-2和抑制IL-12产生的功能,从而促使伤口愈合、发挥调节功能。
(4) 中性粒细胞:
中性粒细胞来源于骨髓造血干细胞,在骨髓中分化发育后,进入血液和组织。中性粒细胞属于小吞噬细胞,具有趋化、吞噬和杀菌等多种生物学功能。
当肠黏膜发生急性炎症反应时,炎症部位的单个核细胞释放趋化因子,使血液中的中性粒细胞穿过血管内皮,大量聚集在肠道固有层和上皮下,有时会穿过上皮到达肠腔。中性粒细胞的这种特性一直被看作是炎症反应的标志。一般情况下,中性粒细胞会在几分钟之内到达炎症或感染部位,24~48小时达到顶峰。到达炎症部位后,中性粒细胞会分泌单核细胞趋化因子如抗菌肽CAP18、组织蛋白酶G、天青杀素,可及时趋化巨噬细胞至炎症部位。
在与入侵微生物接触后,中性粒细胞会通过氧化爆发产生活性氧,以及释放其他由胞内颗粒形成的抗菌肽(如α-防御素),髓过氧化物酶,水解酶(如溶菌酶、唾液酸酶、胶原酶),蛋白酶(如组织蛋白酶G、天青杀素、弹性蛋白酶),阳离子磷脂,金属螯合剂(如乳铁蛋白)。细胞核酸与这些胞内颗粒和毒性分子形成的复合物可以包裹并杀死入侵的微生物,防止病原微生物在体内扩散。当中性粒细胞本身解体时,释放出各种溶酶体酶类能溶解周围组织形成脓肿。
此外,肠黏膜中性粒细胞可促进伤口愈合、黏膜屏障重建;可以控制伤口部位的炎症反应,分泌前列腺素E 2、IL-1β等促进伤口愈合的因子;会分泌大量介质(如花生四烯酸衍生的抗炎脂氧素),延缓自身聚集、抑制自身活化、促进自身凋亡,激活巨噬细胞使其发挥抗炎促修复功能。
(5) 树突状细胞:
树突状细胞来源于多能造血干细胞,通常将其分为浆细胞样树突状细胞(即淋巴系树突状细胞)和传统树突状细胞(即髓系树突状细胞),其中浆细胞样树突状细胞存在于所有淋巴器官,而传统树突状细胞分不同亚型,存在于肠道等不同组织中。传统树突状细胞在健康生物体内始终充满活力,不随时间变化而衰老。肠道树突状细胞广泛存在于大肠和小肠的固有层以及肠相关淋巴组织,包括孤立淋巴结、PP结和肠系膜淋巴结中。
因肠黏膜的特殊性,黏膜树突状细胞执行的任务相当复杂,既要保证营养物质连续通过上皮组织,又要防止有害病原体进入机体引起感染。树突状细胞与上皮细胞的相互作用决定最终的肠道免疫反应是免疫活化还是免疫耐受。在非有害菌刺激下,树突状细胞主要分泌抗炎细胞因子如IL-6、IL-10和TGF-β,迁移至肠系膜淋巴结,使T细胞发育成Th2、Th3和调节性T细胞,诱导B细胞分泌IgA。当致病性细菌入侵黏膜时,树突状细胞分别通过自身和感染的上皮细胞获得细菌信号和第二危险信号。在双信号模式下树突状细胞分泌炎性细胞因子和趋化因子,募集中性粒细胞和单核细胞。最终,树突状细胞被高度活化,迁移至肠系膜淋巴结,促使初始T细胞发育成Th1细胞,诱导B细胞分泌IgA和IgG,导致肠道炎症反应发生。
(6) NK细胞:
由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制,不依赖抗体,因此称为自然杀伤细胞(nature killer cell,NK cell)。NK细胞来源于骨髓,其发育成熟依赖于骨髓微环境。肠道NK细胞主要存在于肠道固有层,在集聚的淋巴组织中比较罕见。肠道NK细胞与其他肠道淋巴细胞的鉴别是比较困难的,目前我们认为肠道淋巴细胞中的NKp46 +RORγt -细胞是NK细胞,因为这些细胞具有传统NK细胞的特性,如表达NK细胞受体和NK细胞依赖性细胞毒作用相关分子等。常用于检测NK细胞的标志有CD16、CD56、CD57、CD59、CD11b、CD94和LAK-1。NK细胞表面有识别感染细胞的重要活化受体,如NKp30、NKp44、NKp46 和NKG2D等,其中NKp44是NK细胞的活化标志。NK细胞可通过多种途径被活化,如表面的CD2、CD3分子和多种细胞因子。
NK细胞胞浆丰富,含有较大的嗜天青颗粒,颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正相关。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早,在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应,其靶细胞主要有某些肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞、寄生虫等。因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素,也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应。
肠道感染后,DC细胞、上皮细胞等释放信号,调节肠相关淋巴组织的发育和功能,包括NK细胞,从而在启动免疫反应和组织修复功能的同时,介导肠道对非致病源和共生菌的耐受状态。NK细胞接受感染信号后,迁移至肠黏膜,通过直接的细胞毒作用清除感染细胞,或通过分泌细胞因子调节其他固有免疫细胞,促进其清除致病原的作用;同时,NK细胞还在控制炎症反应过程、启动适应性免疫系统中起作用。
(7) 肥大细胞:
人肥大细胞由髓系祖细胞发育而来,受某些生长因子如干细胞因子(stem cell factor,SCF)和IL-4等细胞因子影响,这些细胞因子还参与调控肥大细胞亚型的发育。肠黏膜肥大细胞主要位于肠道固有层。
肥大细胞通过Toll样受体(toll like receptor,TLR)识别大量病原体相关分子模式(pathogenassociated molecular patterns,PAMP)和其他细菌产物,激发固有免疫和适应性免疫,保护肠黏膜屏障。肠黏膜肥大细胞与其他部位的肥大细胞表达的TLRs、对PAMP和细菌产物的反应性等不太一样。如,在脂多糖、肽聚糖、酵母聚糖等TLRs的配体刺激下,外周血肥大细胞会有明显应答,但是肠黏膜肥大细胞因为经常接触这些配体刺激而免疫耐受。除TLRs配体外,某些致病原的产物如大肠埃希菌溶血素、Ⅰ型菌毛、霍乱毒素、寄生虫来源的葡糖肽等都是肠道肥大细胞的激活物,过敏原特异性的免疫球蛋白可以与细胞表面的免疫球蛋白受体结合而被肥大细胞识别。
肠黏膜肥大细胞通过释放多种介质发挥生物学功能,包括蛋白酶、组胺、Th1型细胞因子(TNF-α、IL-1β)和Th2型细胞因子(IL-4、IL-13)等。机体发生细菌感染时,肥大细胞通过释放TNF-α和白三烯,募集中性粒细胞和T细胞至感染部位,清除细菌;肥大细胞蛋白酶、IL-4和IL-13在肥大细胞抗寄生虫感染过程中有关键作用;识别过敏原的肥大细胞主要表现为脱颗粒、释放前炎性因子如组胺和类花生酸类物质。
此外,肥大细胞异常活化可增加肠黏膜通透性,破坏肠黏膜屏障功能。肥大细胞食糜酶(mast cell chymase)可增加上皮细胞渗透性、控制上皮细胞迁移;有动物实验证实小鼠肥大细胞蛋白酶1介导紧密连接蛋白的破坏;也有研究表明肥大细胞表面表达的蛋白酶活化受体-2(protease-activated receptor-2,PAR2)被类胰蛋白酶活化,可引起TJ蛋白、ZO-1和紧密连接蛋白的再分配,以及F-actin的重组,从而增加肠黏膜通透性。
(8) γ δ T细胞:
γ δ T细胞是一类不同于α βT细胞的特殊细胞。首先γ δ T细胞数量不多,在外周血仅占CD3 + T 细胞的1%~5%;但在肠道、肺和皮肤等上皮组织中却存在着相当数量的γ δ T细胞,约占T细胞的40%~50%。其次,γ δ T细胞识别抗原无MHC限制性,不需要经过抗原的递呈和加工就可以直接识别抗原,TCRγ δ只具有有限的多样性。
γ δ T细胞与α βT细胞由相同的前体细胞在胸腺中发育而来,其中TCR的信号在其形成中起重要作用。γ δ T细胞成熟后,表达不同γ δ TCR的细胞离开胸腺,迁移至不同组织,其中Vγ5 +γ δ T细胞迁移至肠道。Vγ5 +肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes,IELs)的形成依赖于胸腺中白介素15(interleukin-15,IL-15)的表达,γ δ T前体细胞中IL-15信号通路可以修饰染色体如Vγ5基因片段使基因重排。γ δ IELs前体细胞表达趋化因子受体CCR9,离开胸腺后受其他的可溶性分子如趋化因子CCL25介导归巢至肠道。CCL25-CCR9相互作用可以使γ δ IELs中αEβ7整合素的表达上调,αEβ7整合素与肠道表达的E-钙黏蛋白结合从而介导γ δ IELs黏附于肠上皮。
前体细胞的另一来源被称为“隐窝斑细胞(cryptopatch cells)”,位于肠道固有层,这群细胞对IELs发育的作用最初于1999年被发现。研究显示,缺乏胸腺、淋巴结、PP结和孤立淋巴滤泡的小鼠仍然有功能性的γ δ IELs发育形成;也有研究者证实:胸腺可以转运形成“隐窝斑细胞”的T细胞前体至肠道,经历TCR重排,形成成熟的γ δ IELs。其中IL-15可以修饰“隐窝斑细胞”中包含Vγ5基因片段的染色体。
尽管已有关于外周γ δ T细胞抗原的描述,并且研究显示黏膜γ δ T细胞亚群与MHCⅠ类分子相互作用,但是对于刺激上皮γ δ T细胞的抗原我们了解较少。这些抗原可能是在应激或转化的上皮组织上表达,引起γ δ T细胞活化并分泌细胞因子、生长因子,从而发挥组织修复、杀伤被感染和转化的细胞等功能。
肠上皮γ δ IELs有调节上皮稳态的功能。缺乏γ δ IELs的小鼠,因角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor-1,KGF-1)介导的组织修复功能缺陷,会产生严重的肠道疾病,如炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)。IELs来源的KGF-1表达下调会引起小肠肠绒毛萎缩,而IELs来源的KGF-1表达上调则会引起短肠综合征。IL-7可以上调γ δ IELs的KGF-1表达水平,从而调节γ δ IELs的发育和稳定。
γ δ T细胞有抑制感染的作用。一些γ δ IELs可以识别上皮细胞上的MHCⅠ相关蛋白从而被活化,也可以通过TCR对革兰氏阴性菌感染作出反应,还可以通过TLR4与LPS的作用识别革兰氏阴性菌而被活化。
肠道γ δ T细胞还可以调节炎症反应。将γ δ IELs输入至缺乏γ δ T细胞的小鼠体内,使IFN-γ、TNF-α表达下调,TGF-β表达上调,从而引起结肠炎。此外,γ δ IELs还会促使相邻上皮细胞产生炎症募集因子,如使表皮细胞减少IL-15分泌,增加IL-8、IFN-γ诱导蛋白10分泌。这些细胞因子对维持上皮稳态有重要作用,但是也会募集中性粒细胞至损伤部位,从而加重组织损伤。
(9) NKT细胞:
NKT细胞表面既有T细胞受体(TCR),又有NK细胞受体,是一群特殊的T细胞亚群,其由骨髓造血干细胞在胸腺内发育而来。根据TCR的功能和抗原呈递分子的不同,可将NKT细胞分为四类:前两类具有经典TCR受体并有非多态性MHCⅠ特异性,因V区非变区不同分别称为非变NKT细胞(invariant NKT,iNKT)和黏膜NKT细胞(mucosal NKT,mNKT);第三类NKT细胞对CD1d分子有T淋巴细胞反应,但是具有TCR非限制性,称为变异NKT细胞(variant NKT,vNKT);第四类NKT细胞更加具有异质性,因为这群细胞包括所有表达NK受体的T细胞,被称为xNKT细胞或tgNKT细胞。通过TCR/CD3ε复合物与NK细胞受体如NK1.1(小鼠)和CD161(人)共表达,证实NKT细胞存在于肠道,根据其TCR受体的特点将其归为iNKT细胞。传统NKT细胞识别由非多态性MHCⅠ类似分子CD1d分子递呈的糖脂结构,而小鼠肠道NKT细胞是CD1d非依赖性的,且iNKT细胞主要存在于肠道固有层;人肠道iNKT细胞在总T细胞中的比例不足0.4%,与小鼠一样,主要存在于肠道固有层,但这部分iNKT细胞受α-神经酰胺刺激后可活化并分泌一系列细胞因子。此外,还有一类NKT细胞存在于小鼠和人肠道固有层和肠系膜淋巴结,即mNKT细胞,它们表达效应记忆表型CD27 +、CD44 high、CD45RA -、CD57 -(人),或CD25 low、CD44 high、CD45RB low、CD62L -、CD69 +(小鼠),受刺激活化后可迅速分泌效应性细胞因子如IL-4、IL-5、IL-10、IL-17 和IFN-γ等,且可迁移至炎症部位,通过分泌细胞因子影响炎症过程。
(10) B1细胞:
B1细胞因有异于抗原特异性免疫反应的传统B细胞(即B2细胞)而得名,主要在胎肝和网膜中发育,少部分于出生前在骨髓中发育。肠道B1细胞主要定居于肠道固有层,其BCR多为IgM,少数为IgD,根据其表面CD5表达水平可分为B1a细胞(CD5高表达)和B1b细胞(CD5低表达)。其功能发挥主要通过分泌的IgM抗体介导。该抗体与抗原亲和力低,但是与抗原具有多反应性,识别的抗原主要有:细菌脂多糖、肠道菌群表面磷酰胆碱等多聚糖抗原,变形红细胞、Ig等变性的自身抗原。该类细胞的功能主要为免疫调节、衰老和凋亡细胞的清除、抗感染,以及自身免疫。
研究认为除了B2细胞分泌的抗原特异性IgA以外,大量肠道IgA是非特异性、低亲和力的,对抗原具有广谱特异性。B1细胞因具有免疫球蛋白类别转换功能,且可迁移至肠道固有层分化为分泌IgA的浆细胞,某些B1细胞分泌的IgA可与肠道菌群表面抗原反应,因此被认为是这部分肠道非特异性IgA的主要来源。但是有研究认为B1细胞介导分泌IgA非常有限,大多还是B2细胞分泌的特异性IgA。通过对腹腔中分泌IgA的B细胞亚群分析发现,大多为B1b细胞亚群,不同亚型分泌IgA机制不同。因此肠道IgA分泌的B细胞亚型和机制也需要进一步研究。
(11) 嗜碱性粒细胞:
嗜碱性粒细胞由骨髓干细胞发育而来。IL-3、IL-18、IL-33、GMCSF、IgE、IgD、C5a、免疫复合体,以及上皮细胞来源的细胞因子胸腺基质淋巴细胞生成素(epithelial cell-derived cytokine thymic stromal lymphopoietin,TSLP)都介导嗜碱性粒细胞的活化、发育和归巢过程。在LPS等作用下,嗜碱性粒细胞可分泌促炎细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α等和花生四烯酸代谢产物LTC4、前列腺素D2,介导趋化效应和致炎反应;脱颗粒释放生物胺类、蛋白聚糖、肝素等生物活性物质,参与Ⅰ型超敏反应。最近研究发现嗜碱性粒细胞在某些蠕虫和致敏原的肠道感染过程中,介导肠黏膜细胞的Th2细胞因子反应,这部分嗜碱性粒细胞与TSLP密切相关。嗜碱性粒细胞在发育和功能上都具有异质性,传统意义上的嗜碱性粒细胞是IL-3诱导发育而成,后来发现有一部分嗜碱性粒细胞的发育依赖于TSLP。在肠道蠕虫感染后,肠上皮细胞分泌TSLP,迅速诱导嗜碱性粒细胞活化,使TSLP依赖的嗜碱性粒细胞成为早期反应细胞及时到达感染部位发挥抗感染功能。当CD4 +T细胞活化后,产生的IL-3可诱导传统型嗜碱性粒细胞活化(晚期反应型)并继续发挥抗感染功能。
(12) 嗜酸性粒细胞:
嗜酸性粒细胞由骨髓干细胞发育而来,主要分布于黏膜组织中。在肠黏膜主要分布于黏膜下和固有层,十二指肠绒毛处也有大量嗜酸性粒细胞,健康机体的肠相关淋巴组织如PP结中有极少数嗜酸性淋巴细胞。细胞富含的嗜酸性颗粒中含有丰富的酶类,如过氧化物酶、酸性磷酸酶、组胺酶、磷脂酶D等,细胞表面表达CD45、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素F(sialic acid-binding Ig-like lectin F,Siglec-F)、CCR3、CD11b,低水平的CD11c、中等水平淋巴细胞抗原Gr-1,不表达CD3和c-kit;此外,大肠嗜酸性粒细胞还表达F4/80。在健康机体中,嗜酸性粒细胞被募集至肠道主要依赖于CCL11-CCR3相互作用,肠道固有层单个核细胞组成性表达CCL11。当肠道发生炎症时,CCL11的表达水平显著上升,大量嗜酸性粒细胞迁移至肠道。
嗜酸性粒细胞可被革兰氏阴性菌的脂多糖激活,在细胞外释放线粒体DNA,与嗜酸性粒细胞颗粒蛋白形成胞外结构,结合并灭活细菌,从而维持肠黏膜稳态。当机体被寄生虫感染时,嗜酸性粒细胞通过抗原-抗体复合物结合Fc受体或补体系统而活化,释放毒性颗粒内容物,清除寄生虫。嗜酸性粒细胞可分泌多种细胞因子如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、TGF-β、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ,趋化因子CCL11、CCL5、CCL3,前炎性因子白细胞三烯,炎症保护因子保护素D1(protectin D1,PD1),引起或保护炎症反应;诱导组织修复,同时也导致组织纤维化,使消化道管壁增厚、狭窄、功能受损;参与适应性T细胞的形成,辅助抗体分泌细胞的发育和功能发挥。
2. 固有免疫分子
(1) 细胞因子:
细胞因子是由免疫原、丝裂原或其他因子刺激细胞所产生的分子量可溶性蛋白质或小分子多肽,主要由淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞产生,也可由部分非免疫细胞产生。依据细胞因子的主要功能,可分为白细胞介素(interleukin,IL)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、干扰素(interferon,IFN)、趋化因子家族(chemokine family)、集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)、生长因子(growth factor,GF)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)家族等。在致病微生物感染时,机体启动炎症反应可刺激免疫细胞等产生多种细胞因子,而这些细胞因子又可反过来介导和调节炎症反应、固有免疫及特异性免疫应答等。下面就一些与固有免疫关联较大的细胞因子做一简单概述。
1) 白细胞介素(interleukin,IL)
A. IL-1:IL-1来源广泛,主要由单核巨噬细胞产生,其他几乎所有的有核细胞如淋巴细胞、内皮细胞等都可产生。IL-1具有多种效应,是机体炎症反应与免疫反应的中心介质。首先,其能够增加固有免疫细胞的免疫效应,能够增加中性粒细胞、巨噬细胞、NK细胞的杀伤活性;其次,对免疫细胞具有趋化效应,能够趋化中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞;再次,其可诱导二级细胞因子的产生,刺激单核细胞、巨噬细胞等产生包括IL-6、IL-8和TNF-α的多种细胞因子,促进炎症反应的放大。
B. IL-6:IL-6主要由单核细胞和纤维细胞分泌,其他多种淋巴样和某些非淋巴样细胞如T细胞、B细胞等均可产生IL-6。IL-6是在IL-1、TNF-α等细胞因子作用下产生的二级细胞因子,继而诱导多种细胞合成和分泌急性期蛋白,在急性炎症反应中扮演着至关重要的角色,可反映机体炎症反应的严重程度。在固有免疫中,主要通过与其他细胞因子协同增强免疫作用,可促进中性粒细胞和巨噬细胞的合成分泌、趋化、激活以及抑制凋亡等,此外也可以诱导巨噬细胞和NK细胞等分化。
C. IL-8:IL-8也是一种多细胞来源的细胞因子,可由单核巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞等产生。IL-8是一种趋化因子,在各种非特异性炎症反应中都可观察到IL-8的参与,主要趋化中性粒细胞、T淋巴细胞等,但尚未证实对单核细胞有趋化作用。IL-8主要靶细胞是中性粒细胞,因而在炎症和免疫中主要通过中性粒细胞发挥作用,可促使其表达黏附分子,促进细胞内颗粒物质释放达到杀伤病原微生物的作用。此外,IL-8对嗜酸性粒细胞也具有一定的趋化作用,可能与过敏反应相关。
D. IL-18与IL-21:IL-18与IL-21均是近年来新发现的细胞因子。IL-18主要由巨噬细胞产生,是一种多功能细胞因子,其在T细胞和B细胞中几乎不表达,主要诱导细胞产生多种细胞因子发挥免疫调节作用,尤其是可强效诱导IFN-γ的分泌;IL-18是一种强中性粒细胞趋化和活化介质,此外还可以促进T细胞的增殖分化以及增加NK细胞、Th1细胞表达Fas配体,增强细胞毒作用。IL-21主要由活化的CD4 +T细胞分泌,其效用广泛,在固有免疫中主要诱导NK细胞的增殖和分化,增强细胞毒功能,促进颗粒酶和穿孔素的分泌;可刺激IFN-γ、IL-18等细胞因子的分泌。目前对IL-18与IL-21的认识尚处于初级阶段,有待进一步研究。
E. IL-10:与上述细胞因子不同,IL-10是一种抗炎与免疫抑制性细胞因子。主要由Th2细胞产生,也可由DC细胞、巨噬细胞和调节性T细胞产生。IL-10可直接抑制Th1细胞,减少IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子的产生;主要通过影响DC细胞递呈抗原作用进而抑制T细胞、单核巨噬细胞的活化,限制IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等细胞因子的作用。IL-10对于B细胞的作用与后者所处阶段和状态有关,据报道既有诱导B细胞分化、促进浆细胞成熟的作用,也有促进B细胞凋亡的作用;参与免疫球蛋白的类别转换。
2) 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF):
TNF-α是一种具有广泛生物活性的细胞因子,主要由T淋巴细胞、单核巨噬细胞和肥大细胞等在损伤刺激尤其是LPS的作用下分泌。TNF-α是内毒素介导的最为重要的炎性递质,过量表达将损伤机体,其本身即可引发脓毒血症休克。但是适宜浓度内,通过白细胞和血管内皮细胞发挥作用,具有抵抗病原微生物的作用,可提高中性粒细胞的吞噬活性,刺激其脱颗粒,增强抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)功能;可增加内皮细胞表面黏附分子ICAM-1表达以及IL-1、IL-8等细胞因子的分泌。此外,TNF-α也可激活巨噬细胞,增强其吞噬和杀菌能力。
3) 干扰素(interferon,IFN):
IFN依据结构和功能上的不同分为Ⅰ型(IFN-α、IFN-β)和Ⅱ型(IFN-γ),主要由淋巴细胞和白细胞产生,其中Ⅰ型主要起调节病毒、抗寄生虫和部分胞内菌感染免疫的作用,而Ⅱ型在抗菌免疫中发挥重要作用。IFN-α和IFN-β通过IFN受体A (IFNAR)介导抗病毒反应;IFN-γ通过IFN受体G(IFNGR)激活抗细菌免疫,可激活中性粒细胞、NK细胞、巨噬细胞等,促进炎症发生并增加杀伤活性;促进Th0细胞分化为Th1,抑制Th2细胞;IFN-γ也参与了免疫球蛋白的类别转换。
4) 转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β):
转化生长因子TGF-β是一种调节细胞增殖、分化、免疫应答的细胞因子,正常情况下其发挥很强的免疫负向调控功能,T淋巴细胞、B淋巴细胞是其主要来源。TGF-β可调节多种细胞功能,在炎症反应与免疫反应中发挥重要作用。其可以抑制淋巴细胞增殖,抑制NK细胞、CTL以及巨噬细胞等的活化和细胞毒作用;可调节多数免疫细胞生长繁殖,诱导细胞凋亡;降低免疫细胞对细胞因子的反应性。这种免疫抑制作用降低机体对损伤的抵抗力,有利于肿瘤的生长和转移,但另一方面也减轻了移植的急性排斥反应。
(2) 补体:
补体系统是由普遍存在于血清、组织液和细胞表面的30余种经活化后具有酶活性的蛋白质组成,是固有免疫的重要组成部分。在免疫反应中,当特异性免疫尚未发生时补体可通过旁路途径和凝集素途径发挥作用,特异性抗体产生后则通过经典途径发挥作用。可增强中性粒细胞、单核巨噬细胞等吞噬细胞的趋化性和血管的通透性,有利于固有免疫细胞在损伤部位的聚集;可中和病毒;可与细胞因子协同促进细胞的溶解作用;直接增强吞噬细胞的吞噬作用。此外,补体裂解片段还可发挥趋化(C3a、C5a、C567)、调理(C3b、C4b)、免疫黏附(C3b)及促炎作用(C3a、C5a),促进免疫细胞溶解靶细胞、细菌和病毒。
(3) 抗菌肽:
抗菌肽是机体在抵抗病原微生物的过程中产生的具有抗微生物活性的小分子多肽,是固有免疫的重要成员,具有广谱抗菌、抗病毒等免疫学活性,可有效抑制G -菌、G +菌、分枝杆菌、真菌和被膜病毒和寄生虫等,对肿瘤细胞也有较强的细胞毒作用。抗菌肽发挥抗菌作用可能主要是通过静电作用与微生物细胞膜结合,抗菌肽的疏水端在电势能驱动下插入细胞膜,使致病原微生物的膜屏障破坏而死亡。有研究显示抗菌肽发挥抗菌或抗病毒作用也可能通过抑制DNA复制和转录、抑制细菌细胞酶活性等发挥作用;随后因浓度下降,抗菌肽更多的是通过其趋化活性发挥作用,可趋化单核细胞等固有免疫效应细胞聚集到损伤部位,也可趋化DC细胞、T淋巴细胞等启动特异性免疫应答。此外,抗菌肽还参与肠黏膜化学屏障的组成。
3. 固有免疫应答
(1) 肠道固有免疫的作用时相:
当机体发生感染时,固有免疫应答分为三个作用时相(图2-8),即时固有免疫应答、早期固有免疫应答和适应性免疫应答诱导阶段。
图2-8 固有免疫的三个作用时相
1) 即时固有免疫应答:
发生于感染0~4小时,肠上皮细胞形成的物理屏障、其分泌液中的抗菌物质形成的化学屏障、黏膜表面的正常菌群形成的生物屏障产生即时防卫作用,阻止病原体对上皮细胞的黏附。如病原体穿过肠黏膜屏障,进入黏膜下组织时,可被分布于该处的巨噬细胞、中性粒细胞等吞噬清除。绝大多数病原体感染终止于该时相。
2) 早期固有免疫应答阶段:
发生于感染4~96小时。该时期,吞噬细胞活化,吞噬功能增强,分泌大量细胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α等,引起炎症反应,使血管扩张、通透性增强,有助于血管内补体、抗体和急性期蛋白等免疫效应分子进入感染部位,同时募集血管和周围组织中的吞噬细胞到达感染部位。产生的细胞因子还可激活NK细胞和γ δ T细胞,增强早期固有免疫应答,同时诱导适应性免疫应答。
3) 适应性免疫应答诱导阶段:
发生于感染96小时后。活化的巨噬细胞、树突状细胞等作为抗原呈递细胞,将加工处理过的病原微生物等抗原携带至局部淋巴结等处,通过与适应性淋巴细胞相互作用,诱导适应性免疫应答发生。
(2) 肠道固有免疫识别:
固有免疫应答是机体防御感染性疾病的第一道防线,在过去的研究中被认为只是免疫系统应答外界刺激的一种低等形式。但随着对免疫系统的深入了解,固有免疫系统在机体免疫防御、免疫监视和自身稳定中的作用越来越受到免疫学家的关注。根据“模式识别理论”,固有免疫针对的主要靶分子信号被称为病原相关分子模式(PAMPs),相对应的识别受体被称为模式识别受体(PRRs)。
PRRs是一类跨膜蛋白,主要表达于固有免疫细胞表面、内体、溶酶体、细胞质中,可识别一种或多种PAMPs/DAMPs的分子。来自不同组织的同类固有免疫细胞均表达相同PRR,PRRs包括Toll样受体(TLRs)、核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide binding oligomerization domain,NOD)样受体(NOD like receptors,NLRs)、RNA解旋酶(RIG-I、MDA5和LGP2)、C型凝集素受体和细胞内DNA传感器(DAI、AIM-2、 LRRFIP1、 RNA聚合酶Ⅲ、DExD/H框RNA解旋酶和IFI16)。肠上皮细胞表达PRRs情况见表2-1。
表2-1 肠上皮细胞PRRs的表达情况
续表
(表格来源于Mucosal Immunol. 2013 May;6:451-463.)
TLRs是PRRs的一大家族,是一类跨膜蛋白,在肠道主要表达于肠上皮细胞表面或内体,包括13个成员,其中TLR1~TLR9都在人类肠黏膜细胞上表达。肠道TLRs信号通路的功能与上皮细胞增殖、IgA分泌、紧密连接的维持以及抗微生物肽的分泌有关,从而保持肠黏膜屏障功能正常。TLRs识别PAMPs或DAMPs后,可以启动固有免疫应答,活化下游信号通路,引起一系列细胞因子、趋化因子或抗微生物肽分泌。
NLRs是另一类固有免疫受体,包括NOD1、NOD2、NLRC4、NLRP3、NLRP6等。有些NLRs活化后可以组装成多分子复合物,导致炎性胱天蛋白酶如胱天蛋白酶1的活化。这种多分子复合物被称为炎性小体,它们可以活化必要的胱天蛋白酶以传播炎症信号。
NOD1表达于肠上皮细胞,可以识别入侵的革兰氏阴性菌,其特异性配体仅于革兰氏阴性菌的肽聚糖中发现。入侵的微生物可以通过细胞内NOD1引起肠上皮细胞的固有免疫反应,从而使NOD1间接发挥抗微生物作用。
NOD2的配体被称为C末端胱天蛋白酶募集域15(C-terminal caspase recruitment domain 15,CARD15),是来自于常见革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的肽聚糖,是一种胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)。NOD2高表达于单核细胞和潘氏细胞,对于肠道菌群的定植可能有重要作用。NOD2通过分泌杀菌因子调节肠道菌群,如果该信号通路发生障碍,则导致肠黏膜不能正常分泌抗菌肽、免疫细胞异常反应,从而导致炎症发生。
NLRP3及其下游的ASC和caspase-1对肠道炎症抑制和促进双重作用,活化的NLRP3可形成炎性小体。NLRP6信号通路通过下调CCL15,调节肠道菌群的组成,从而控制炎症反应。如果该通路发生障碍,肠道固有层中CD45 +细胞数量增加、结肠隐窝增生、形成生发中心而致PP结扩张。
(3) 肠道固有免疫应答:
肠黏膜屏障作为一个有效的物理、化学和生物屏障,正常情况下,大多进入肠道的病原微生物都被控制在局部或被清除,很少导致临床疾病的发生。但是当大量病原微生物入侵机体,肠黏膜屏障不足以抵抗病原微生物对肠黏膜造成的损伤,形成局部感染灶,微生物复制并扩散,肠道固有免疫反应即被启动。
肠上皮细胞是抵御肠道菌群的第一道屏障,其通过固有免疫受体识别肠道菌群后,立即分泌大量抗菌肽和细胞因子(如IL-10和TGF-β)至固有层,从而活化其中的免疫细胞。至于肠上皮如何区分致病菌群和非致病菌群,可能的机制为:肠上皮TLRs的表达具有限制性表达,如TLR5只表达于上皮细胞的基底外侧表面,从而确保其只能被入侵固有层的细菌活化;某些分子的细胞定位,如TLR3、TLR8和TLR9仅存在于细胞内和内体的细胞器,而NLRs仅存在于胞质区,保证PRRs不能识别肠道管腔中的共生菌,但可以识别入侵上皮的致病菌。
肠上皮细胞可分泌IgA并释放至管腔中,对抗微生物、中和致病菌、控制共生菌。这些肠腔中的分泌型IgA由PP结或其他MALT迁移过来的浆细胞分泌。TLR2也是一个肠道B细胞归巢受体,诱导IgA分泌。活化TLR2信号通路可诱导健康人循环B细胞表面趋化因子受体CCR9、CCR10表达和IgA的分泌,表达CCR10的IgA +B细胞可被上皮分泌的趋化因子CCL28募集至肠道固有层。
潘氏细胞位于小肠隐窝,从小肠隐窝到远端位置其数量逐渐增加,在回肠末端数量最多。这些专职分泌细胞分泌抗微生物蛋白、溶菌酶和α-防御素,以及分泌型磷脂酶A2和凝集素RegⅢγ。与仅由潘氏细胞分泌的α-防御素不同,β-防御素可由多数肠上皮细胞分泌。潘氏细胞具有独立的机制监测和识别潜在的入侵细菌,表面表达PRRs,如NOD2、TLR2、TLR4、TLR5和TLR9,通过这些受体介导的信号通路可以诱导抗菌肽和凝集素的分泌。口服TLR配体可以诱导潘氏细胞脱颗粒。用TLR9和TLR3激动剂治疗可诱导潘氏细胞快速脱颗粒,TLR4和TLR5激动剂诱发TNF-α介导的迟发型脱颗粒。克罗恩病最频繁的受损部位是回肠末端,这种患者最明显的特点之一就是无法清除肠道病原体。最近有人提出“潘氏病”的概念,表示克罗恩病患者的抵抗微生物能力可能与潘氏细胞有关。潘氏细胞功能失调的机制可能有几种:固有免疫受体NOD2的变异,自噬蛋白ATG16L1、TLR9、α-防御素5,以及内质网压力反应性转录因子XBP1的突变都参与其中。因为高度活跃的分泌活性,潘氏细胞对内质网压力非常敏感。在内质网压力下,蛋白未折叠或错误折叠,导致未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)活化。UPR可以激活修复蛋白折叠的信号通路,但如果UPR持续时间太长就会引起细胞凋亡。
当病原微生物越过肠黏膜屏障进入组织后,首先与病原微生物遭遇的细胞是巨噬细胞。病原微生物表面表达的PAMPs与巨噬细胞表面的PRRs相互作用,诱导巨噬细胞吞噬、杀死病原体。同时,活化的巨噬细胞释放大量细胞因子、趋化因子和炎症因子,募集中性粒细胞等至感染部位。分布于肠黏膜的肥大细胞通过自身表达的PRRs,也能识别病原微生物,释放趋化因子等募集中性粒细胞到感染部位,启动炎症反应;肥大细胞还可对表面结合IgE抗体的特异性抗原迅速应答,募集并活化嗜碱性和嗜酸性粒细胞,有利于IgE介导的应答,在抗寄生虫感染中有重要作用。
DC细胞和巨噬细胞在微生物入侵和炎症反应时启动固有免疫应答有非常关键的作用。CX3CR1 +CD11b +CD11c +DC细胞特异性表达CD70,通过表达一系列ATP受体诱导Th17细胞的发育,共生菌来源的ATP对于Th17细胞的发育有重要作用。相反,CD103 +DC细胞通过分泌视黄酸和TGF-β促使FoxP3 +Treg细胞分化,从而导致免疫耐受。TLR5活化的CD103 +CD11c +DC细胞具有Th1/Th17极化能力。CD103 +DC细胞能刺激CD4 +和CD8 +T细胞增殖,TLR配体活化的CD103 +DC细胞能强烈诱导细胞毒性T淋巴细胞。此外,CD103 +DC细胞在鞭毛蛋白诱导分泌IL-23过程中起作用,导致IL-22表达及后续的抗微生物凝集素再生胰岛衍生蛋白Ⅲγ(regenerating islet-derived protein Ⅲγ,RegⅢγ)在肠上皮细胞持续性表达。CD103 +DC细胞介导多重反应,保持对肠道抗原的免疫耐受,通过引导T细胞活化和微生物防御促进保护性免疫。除了CX3CR1 +CD11b +DC细胞和CD103 +DC细胞,还有表达钙黏蛋白E的DC细胞,这类细胞高表达TLRs,分泌IL-6、IL-23等细胞因子,通过Th17细胞的反应增强肠道免疫反应。
巨噬细胞对入侵机体的病原体的应答分为识别、吞噬和消化三个阶段。巨噬细胞通过自身表达的多种受体(如甘露糖受体、清道夫受体、LPS受体、Toll样受体等)直接或间接识别病原体,经胞膜突出形成的伪足包裹病原体后融合形成吞噬体,吞噬体向细胞内部运动,在巨噬细胞内的溶酶体、防御素等作用下被清除。
当组织发生感染时,经巨噬细胞和肥大细胞释放的细胞因子、趋化因子等作用,12个小时之内大量中性粒细胞被募集至感染部位,成为急性炎症反应的标志。中性粒细胞识别和吞噬病原微生物的过程与巨噬细胞相似,发挥作用后即凋亡。
受细菌LPS等刺激后,肠黏膜NK细胞通过释放穿孔素、颗粒酶等直接杀伤感染细胞;或通过FasL、TRAIL等与感染细胞表面表达的相应配体结合,诱导感染细胞凋亡;或借助ADCC作用发挥杀伤效应。此外,NK细胞可通过影响DC细胞、T细胞和B细胞等免疫细胞的功能发挥其免疫调节功能。
NKT细胞通过分泌IFN-γ参与抗细菌、病毒、真菌和原虫的感染;通过分泌大量IL-4、IFN-γ、GM-CSF等细胞因子和趋化因子,活化其他免疫细胞,间接发挥免疫防御作用。
γ δ T细胞能直接识别CD1d、MICA、MICB、磷酸化抗原和热休克蛋白等。活化的γ δ T细胞通过释放细胞毒性效应分子、表达Fas/FasL等,清除感染细胞和病原微生物;此外,还可通过释放IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α等多种细胞因子,参与免疫调节。
B1细胞在未受刺激的情况下分泌IgM,是天然IgM抗体的主要来源。经病原微生物刺激后,肠道固有层和肠系膜淋巴结的B1细胞能分泌IgA,有助于黏膜免疫的维持。
此外,嗜酸性粒细胞选择性吞噬抗原抗体复合物,嗜碱性粒细胞分泌大量Th2型细胞因子等参与免疫应答。
细胞因子、补体、抗菌肽等固有免疫分子在固有免疫应答中起重要作用,其作用主要有以下几方面:
1) 对病原微生物或感染细胞等直接清除或发挥细胞毒作用,如抗菌肽可直接抑制细菌、真菌、病毒和寄生虫等,对肿瘤细胞也有较强的细胞毒作用;TNF-α、IFN-γ等都有直接的杀菌或细胞毒作用。
2) 通过影响其他免疫细胞间接发挥免疫效应,如IL-1、IL-18、补体等对免疫细胞有趋化效应、可增强其他免疫细胞的免疫效应。
3) 诱导二级细胞因子的产生,形成级联反应。如IL-1、IL-21、TNF-α等。
4) 免疫抑制功能,如IL-10可直接抑制Th1细胞,减少IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子的产生,通过影响DC递呈抗原作用进而抑制T细胞、单核巨噬细胞的活化;TGF-β可以抑制淋巴细胞增殖,抑制NK、CTL以及巨噬细胞等的活化和细胞毒作用,降低免疫细胞对细胞因子的反应性。
(4) 肠道固有免疫应答的调节:
肠道固有免疫系统的免疫分子和免疫细胞之间形成相互调节的环路,维持机体免疫系统的平衡。肠道固有免疫系统还可通过固有免疫分子和固有免疫细胞,启动适应性免疫应答,调节适应性免疫应答的类型和强度。此外,适应性免疫系统也可对固有免疫系统进行调节。通过相互调节,肠道免疫系统才能维持稳态,并形成自身免疫耐受。具体内容详见肠道的免疫调节。
综上所述,机体和细胞对损伤性因子所产生的最早的固有免疫应答形式是炎症反应,这种固有免疫应答是由多细胞、多分子参与的网络级联反应。首先感染局部的巨噬细胞识别并清除入侵机体的致病因子,分泌细胞因子和趋化因子,肥大细胞释放炎性因子。这些因子募集效应细胞到达感染部位,如中性粒细胞、NK细胞等,发挥其吞噬作用、细胞毒作用以及免疫抑制作用,参与固有免疫应答和调节,并进一步启动适应性免疫应答。
三、 肠道适应性免疫系统
1. 适应性免疫系统的组成
肠道适应性免疫系统主要由肠道相关淋巴组织(GALT)和细胞、免疫分子组成。结构完整和功能完善的肠道免疫系统对大量无害抗原下调免疫反应或产生免疫耐受,对有害抗原和病原体产生高效体液和细胞免疫,进行有效免疫排斥或清除。
(1) 肠道相关淋巴组织及免疫细胞:
肠道相关淋巴组织(GALT)数量庞大,抗原负载于其暴露位置,能够影响免疫系统,是人体最主要的黏膜相关淋巴组织(mucosal associated lymphoid tissue,MALT)。GALT与肠上皮共同构成机体防御外来抗原的第一道防线,按解剖和功能GALT可以分为诱导部位和效应部位。
1) 诱导部位:
A. PP结(Peyer's patch)是小肠黏膜免疫系统的重要组成部分,其分布、结构等详见本章第三节第一部分相关内容。由于PP结含有各种必需的免疫活性细胞,因此被认为是黏膜免疫反应的主要诱导部位。PP结的上皮下圆顶区有特殊化的抗原识别细胞M细胞(microfold cell),它可以摄取肠腔内多种抗原(图2-9)。抗原转运至PP结内,在滤泡区加工,活化抗原特异性B细胞和T细胞,随后被转运至黏膜固有层和上皮内的淋巴细胞。
图2-9 M细胞和PP结的结构
B. M细胞:具体结构详见本章第三节第二部分相关内容。M细胞摄取肠腔内抗原,尤其是颗粒型抗原,内化之后以囊泡的形式递呈给下方的巨噬细胞等抗原呈递细胞(antigenpresent cell,APC),后者处理抗原后,递呈给淋巴细胞。可溶性抗原和完整的细菌都可以被M细胞内化。M细胞是大分子物质非受体转运的主要生理途径,而它对微生物的选择性可能与其表面相应受体有关。因此M细胞能调控抗原从肠腔转运至PP结,构成免疫监视的一部分。
C. B细胞:PP结内M细胞摄取肠腔内抗原物质,转运并递呈给下方的淋巴细胞。后者进入黏膜淋巴小结和肠系膜淋巴结内增殖分化为幼浆细胞,然后经淋巴细胞再循环途径,大部分返回消化管黏膜,并转变为浆细胞。浆细胞主要产生IgA。PP结内的B细胞主要分布在淋巴滤泡,淋巴滤泡受抗原刺激形成生发中心,内含大量增殖淋巴母细胞,多数为IgA +细胞,少数IgM +、IgD +细胞位于滤泡间区。位于PP结圆顶下的生发中心含有处于分化阶段的正在经历亲和力成熟的B细胞,并发生IgA类别转换。PP结中的大部分B细胞用于合成IgA,最终分泌的IgA在黏膜表面提供适应性免疫保护。当PP结受到抗原刺激后,IgA +淋巴母细胞通过淋巴和血液循环最终定位于黏膜固有层。PP结中B细胞高频率地同型IgA类别转换,可能受转化生长因子-β 1(transforming growth factor-β1,TGF-β 1)的影响,而PP结内多种细胞均可合成分泌TGF-β 1,如调节性T细胞(regulatory t cell,Treg)、滤泡T细胞、树突状细胞(DC)等。
D. T细胞:PP结内的T细胞区与B细胞区相邻,主要位于滤泡间区,能够对M细胞内化并转运的抗原做出应答。PP结中的T细胞包括CD4 +和CD8 +T细胞,95%以上的T细胞表达α βTCR,一小部分表达γ δ TCR。在PP结中50%~60%的α βT细胞都是CD4 +T细胞且表型成熟,剩下的是CD8 +T细胞,包括细胞毒性T细胞前体。PP结中同时含有幼稚T细胞和活化T细胞,提示PP结是淋巴细胞再循环通路的一部分。
2) 效应部位:
抗原活化的B细胞和T细胞通过肠系膜淋巴结、胸导管和血流从黏膜诱导部位向黏膜效应部位迁移。
A. 固有层:固有层位于上皮和黏膜肌层之间,含有丰富的淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、DC细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞。
APC:固有层内含有大量的巨噬细胞和DC细胞,它们负责加工穿越上皮的抗原,并将处理的抗原呈递给CD4 +T细胞。
T细胞:固有层淋巴细胞(lamina propria lymphocyte,LPL)中约40%~90%为T细胞。固有层T淋巴细胞的个体发生可能为胸腺起源,幼稚T细胞进入PP结和淋巴滤泡,与抗原相遇,之后重新进入循环,然后归巢至固有层。不同淋巴细胞表面标志物比较见表2-2。固有层T细胞具有典型的活化T细胞相关标志物,如α4β7 +、CD45RO +、CD25 +和HLA-DR。
表2-2 不同淋巴细胞表面标志物比较
固有层T细胞的功能主要包括:
辅助和抑制功能:CD4 +T细胞能促进IgA合成,且此功能不需要丝裂原激活,而CD8 +T细胞可抑制免疫球蛋白合成;
细胞因子分泌:固有层T细胞既可产生Th1型也可产生Th2型细胞因子,但以Th2型为主。
B细胞:固有层内的浆细胞前体来自PP结,通过肠系膜淋巴结和胸导管而到黏膜固有层。这个过程很可能是受到固有层细胞或肠道上皮细胞分泌的特异性趋化因子与B细胞受体之间的相互作用的介导。固有层内的B细胞表达αEβ7整合素,其能够与黏膜上皮细胞表达的黏膜地址素细胞黏附分子(mucosal addressin cell adhesion molecule-1,MAdCAM-1)相互作用,因此B细胞能定位于黏膜层。正常情况时,肠黏膜固有层含有大量浆细胞,其中70%~90%分泌IgA。固有层T细胞合成的细胞因子IL-2、IL-4和IL-5可促进IgA +浆细胞的生成。类别转换和IgA +浆细胞分化还可以一种非依赖T细胞的方式进行,是由LPS和基质细胞分泌的转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白细胞介素-10 (interleukin-10,IL-10)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)介导发生的。
B. 肠道上皮:肠道上皮在肠道免疫调节中亦发挥着重要作用,是另一个淋巴样效应部位。肠道上皮可产生大量黏膜免疫调节细胞因子,可以摄取肠腔中的抗原,并对其进行加工后递呈给致敏的T细胞。肠上皮细胞表达MHCⅠb和MHCⅡ类分子,且MHC分子的表达受淋巴细胞来源的一些细胞因子如IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IFN-γ和TNF-α的影响,这就间接表明了黏膜上皮与淋巴细胞之间存在着“对话”(crosstalk)。肠道上皮与T细胞相互作用中,上皮细胞优先刺激CD8 +致敏T细胞。
在小肠上皮中,位于基底膜上方上皮细胞之间的淋巴细胞群被称为上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,IELs),它们与外来抗原直接接触,是体内最大的淋巴细胞群。每4~9个肠上皮细胞之间就有一个IEL,其几乎占到所有淋巴样器官T细胞总数的一半。
由于结肠与小肠微生物环境不同,因此IELs免疫反应调节也不同,两者之间免疫细胞的主要区别见表2-3。
表2-3 结肠与小肠IELs表型与功能的区别
(2) 免疫分子IgA:
体内分泌的IgA比其他所有类别抗体的总和还多,至少80%的浆细胞位于肠道固有层,而大多数IgA分泌入肠腔,因此分泌型IgA是肠道黏膜表面的第一道免疫防线,其分泌受神经、内分泌和免疫系统的调节。分泌型IgA能抑制肠道内的细菌黏附肠道黏膜表面,中和肠道内的毒素、酶和病毒,对肠道菌群中的G -杆菌具有特殊的亲和力,对一些抗原物质具有封闭作用。因此,分泌型IgA作为黏膜表面的第一道免疫防线能够抵抗各种内源及外源性病原体。
1) IgA的组成和结构:
按照IgA的产生部位和体内分布的特点可分为两型即血清型和分泌型IgA(sIgA)。血清型主要由骨髓产生,直接释放入血,一般为IgA单体;分泌型主要由黏膜产生,然后转运到黏膜腔,与J链和分泌片即多聚免疫球蛋白受体(pIgR)结合形成sIgA,主要是二聚体。人类IgA有两个同种型,IgA 1和IgA 2。
IgA 1:主要以单体的形式存在于血清中,也是黏膜分泌物之一。在嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的表面有一种IgA 1受体,即FcαR1/CD89,能够诱导细胞吞噬作用、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)和炎性分子的分泌。
IgA 2:是由两个IgA分子的α链通过J链相连形成的二聚体。固有层中的浆细胞释放sIgA,它与黏膜上皮细胞结合后,通过内吞和转运作用由细胞顶端释放。结合sIgA的跨膜受体是pIgR,两者结合形成受体-配体复合物。pIgR-IgA复合物在上皮细胞内转运前与转运过程中,能够结合抗原,使渗入黏膜屏障的抗原能重新回到肠腔,使无法通过其他方法进入肠腔的IgG和IgM可以通过上皮层的转运到达肠腔。
2) IgA的诱导:
GALT是黏膜免疫系统最重要的功能区,包括PP结和孤立淋巴滤泡(isolated lymphoid follicle,ILF)中的诱导部位及效应部位,含有IgA浆细胞前体。在这些免疫中心部位,B细胞、携带抗原的DC和局部CD4 +T细胞之间能够发生相互作用。PP结和肠道微环境持续暴露并受到外界抗原刺激是IgA分泌型B细胞存在于肠道、IgA类别转换的条件。GALT中的B2细胞分泌IgA需要两个条件,一是与辅助性T细胞相互作用,二是依赖与共生菌群的相关作用,但是,B1细胞合成IgA并不依赖于T细胞。B1细胞合成的IgA在抵御肠道细菌全身侵袭的前线中发挥重要作用,且有证据支持此观点:①与B2细胞合成的IgA相比,共生菌群更多的是与B1细胞合成的IgA相结合;②能够合成共生菌群特异性肠道IgA(B1细胞合成的)的正常小鼠血清中没有共生菌群特异性IgG或IgA。
3) IgA的归巢:
IgA +B细胞从PP结的诱导部位迁移到肠系膜引流淋巴结,进一步增殖后,分化成浆细胞。这些细胞通过胸导管和血液归巢至肠道固有层,依赖于淋巴细胞受体和上皮细胞配体之间的特异性相互作用。但对于为什么IgG和IgM浆细胞不能归巢至肠道固有层,其原因现在还不清楚,可能与局部肠道细胞合成一种特异性趋化因子有关。
4) IgA的类别转换:
sIgA浆细胞在黏膜淋巴滤泡中发育,都沿上皮层分布,弥散定居于黏膜下层各位点。通常IgM +B细胞遭遇抗原刺激和(或)在T细胞调节下,可分化为IgA +B细胞。TGF-β和IL-4能促进IgM向IgA转换,而且IL-10能够和TGF-β发挥协同作用。IL-2能增强这种活性,但它不是必不可少的。此外,细胞发生IgA转换后,IL-5和IL-6能够增强抗体的分泌。
2. 肠道适应性免疫的作用机制
(1) 肠道适应性免疫应答的基本过程:
当食物或细菌抗原接触胃肠道后,大部分抗原成分主要由肠集合淋巴结表面的M细胞吸收,还有少部分通过肠道黏膜固有层内树突状细胞的突触直接伸向肠腔内摄取,以及通过上皮细胞间的缝隙直接吸收,进而引起一系列的肠黏膜局部免疫反应。肠道内细菌或食物抗原通过肠腔面的M细胞或通过其他途径吸收进入集合淋巴结及肠黏膜固有层后,巨噬细胞和树突状细胞将抗原加工处理后传递至集合淋巴结的生发中心或肠黏膜固有层的淋巴细胞(图2-10)。在TGF-β、IL-4、IL-5、IFN-γ和抗原刺激下,B淋巴细胞增殖并转化成细胞表面含IgG、IgA、IgE等特异性浆细胞,而T淋巴细胞激活分化成免疫效应细胞,包括Th1、Th2、Th17细胞、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)。在生理情况下,活化的CD4 + T细胞主要以Th2形式、少部分以Th3、Treg细胞形式存在,构成肠黏膜免疫保护作用。通常上述激活的淋巴细胞仅小部分直接分散在黏膜固有层内,而大部分经淋巴循环进入肠系膜淋巴结,再通过淋巴循环(胸导管)进入血液循环系统,最后归巢于肠道黏膜组织固有层内,参与黏膜免疫调节。sIgA是胃肠道和黏膜表面主要的免疫球蛋白,对消化道黏膜防御起着重要的保护作用。肠腔内sIgA通过结合细菌将肠道内细菌聚集起来,形成抗原抗体复合物并刺激肠道黏液的分泌以及加速黏液在肠黏膜表面的移动,有助于排除肠道中的细菌和内毒素。
图2-10 黏膜免疫系统与黏膜免疫应答的诱导
(2) 抗原的识别、处理和递呈
1) M细胞对抗原的转运:
由于黏膜表面覆盖有一层上皮细胞,正常情况下仅极少部分外源性病原体感染上皮细胞后可直接进入宿主内,绝大多数抗原无法直接接触到肠黏膜下淋巴组织而诱导免疫反应。肠腔内的抗原主要是经M细胞转运或树突状细胞捕捉后传递给PP结中的淋巴细胞。
在Balb/c小鼠肠道PP结的FAE中,M细胞游离面缺乏与吸收功能有关的纹状缘,表面糖萼不发达,与消化吸收有关的碱性磷酸酶活性低,基底质膜向肠腔方向凹陷,形成上皮内腔室结构,腔室内聚集着T淋巴细胞和B淋巴细胞,这一结构缩短了抗原转运的路径。M细胞顶部和周边胞质很薄,终末网不发达,有丰富的囊泡和较多的线粒体,缺乏溶酶体和酸性磷酸酶样结构。M细胞下方的基底膜是不连续的,淋巴细胞能自由通过。M细胞特异的形态结构和定位有利于抗原转运。
M细胞在FAE上皮中只占微小的部分,但是却能够十分有效地黏附病原体。首先,M细胞具有特异的糖萼和受体,容易被细菌和病毒所识别;其次,M细胞顶膜面缺乏其邻近肠上皮细胞膜表面具有的硬刷状缘、糖萼以及黏液,因此M细胞顶膜面关键的膜成分(如特异的糖萼或受体)易被细菌或病毒识别和接近。M细胞顶膜面的糖萼由糖复合物构成,其糖基排列和构成与邻近的肠上皮细胞不同,同一FAE中的不同M细胞之间也不尽相同,而且存在物种和部位的差异,在不同动物种属或同种动物肠道的不同区段其顶膜表达的糖萼不同,这种特异性的糖萼有助于M细胞黏附摄取各种微生物。
M细胞顶膜摄入抗原可能涉及不同的机制,包括液相胞吞、受体介导的胞吞以及吞噬作用等。研究证实病原体黏附M细胞后,会激活M细胞内信号通路,导致局部胞浆钙浓度升高,引起细胞骨架的收缩,使细胞膜突起变皱,最终造成病原体被胞吞。至于M细胞具体通过哪种机制摄入抗原,可能与抗原的大小和特性、表面的电荷以及抗原所具有的受体有关。M细胞能从肠腔摄入抗原,跨上皮转运后传递给其下方的淋巴细胞,因此在诱导黏膜和系统免疫反应中起重要作用。
M细胞黏附抗原后,经网格蛋白包被的小窝把它们传递到位于“口袋”上方的基顶膜下的内体。在M细胞的这一部位有少量多泡状内体,无含酸性磷酸酶的结构,溶酶体也很少,使抗原在转运中不致被降解。在复层或假复层上皮黏膜部位,DC细胞犹如游动的“巡逻舰”捕捉黏附到上皮的抗原,然后游走回到局部或PP结内,将抗原呈递给淋巴细胞。
尽管DC细胞能直接从肠腔中捕捉抗原,M细胞仍然被作为最重要的抗原呈递细胞被研究。研究发现暴露于病原体的M细胞所介导的跨FAE转运抗原的能力可迅速提高,这是由于M细胞转运速度加快,而不是其数量的增加所致。有研究报道抗原还可通过一种非FAE相关的肠绒毛M细胞进入黏膜组织。肠绒毛M细胞属于不依赖于PP 结的、抗原特异性黏膜免疫反应的诱导部位。
2) 非专职抗原呈递细胞对抗原的摄取、处理和递呈:
覆盖在黏膜表面的上皮细胞也作为非专职APC,对黏膜面抗原摄取、处理、递呈。正常情况下肠上皮细胞并不表达共刺激分子B7-1和B7-2或细胞间黏附分子(intercelluar adhesion molecule-1,ICAM-1),但能摄入可溶性肽抗原。活化的CD8 +T细胞和肠上皮细胞表达的gp180分子是一种新的免疫球蛋白超基因家族成员,是T细胞表面分子CD8的重要配体,所以缺乏共刺激信号刺激的肠上皮细胞将抗原呈递给CD8 +T细胞,引起免疫抑制或耐受。而在感染的情况下,肠上皮细胞表达共刺激分子ICAM-1,将抗原呈递给CD4 +T细胞,触发黏膜免疫反应。有研究发现肠上皮细胞表达多种非传统的MHCⅠ分子,肠上皮细胞可利用这种分子作为非专职APC直接递呈细菌性抗原,这种非传统的MHCⅠ分子还可作为共刺激分子或黏附分子降低黏膜免疫反应。
总之,通过非传统的MHCⅠ分子的表达,肠上皮细胞成为肠腔抗原与黏膜免疫系统持续“对话”的关键媒介。
3) 专职抗原呈递细胞对抗原的摄取、处理和递呈:
因为M细胞能摄取和转运抗原给淋巴细胞,最初认为PP结中的APC主要是M细胞,但研究发现M细胞并不表达MHCⅡ类分子,而MHCⅡ类分子对于T细胞与APC之间的相互作用必不可少。M细胞主要是以受体介导胞吞的方式非特异性摄取和转运抗原,不能递呈抗原,因此M细胞不是真正意义上的APC。专职性APC包括DC细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞,都组成性表达MHCⅡ类分子,能主动摄取抗原并加工处理抗原,递呈抗原信息给T淋巴细胞。
DC细胞是专职的抗原呈递细胞,研究发现小肠黏膜固有层DC细胞能形成贯穿基底膜和上皮层的树突伸入肠腔,通过一种依赖于趋化因子受体CX3CR1[chemokine (C-X3-C motif) receptor 1]的机制,摄取肠腔中的细菌。它能将活的共生菌从肠腔转运到肠系膜淋巴结,能选择性诱导IgA的产生,以帮助黏膜阻止共生菌的渗入。载有共生菌的DC细胞被肠系膜淋巴结限制在黏膜淋巴组织,以确保针对共生菌特异的IgA免疫反应局限在肠黏膜,而不激发系统免疫反应。在肠道黏膜中,DC细胞可以诱导T细胞的免疫耐受,诱导Treg细胞分化和迁移至滤泡间区中。
巨噬细胞表面表达多种与抗原摄取相关的表面分子,如FcR、补体受体、甘露糖受体、清道夫受体、Toll样受体等,通过吞噬作用和受体介导的胞吞作用摄取抗原,能在细胞内加工处理抗原形成抗原肽-MHCⅡ类分子复合物,递呈给T细胞。但是巨噬细胞不能将抗原信息递呈给初始T细胞,只能递呈给活化T细胞或效应T细胞,其抗原呈递能力显著弱于DC细胞。
(3) 黏膜淋巴细胞的归巢、T/B细胞的分化、抗体的产生
1) 黏膜淋巴细胞归巢:
受一系列表达于淋巴细胞和高内皮静脉上的受体与配体之间的相互作用的调控,黏膜淋巴细胞从诱导部位归巢到效应部位的过程,称为黏膜淋巴细胞的归巢,多种黏附分子、趋化因子和受体在该过程中起重要作用。黏膜相关淋巴细胞表达的归巢受体不同,黏附分子在血管内皮细胞上的表达也呈组织特异性。在归巢受体介导下,PP结中致敏的淋巴细胞移行到致敏部位的肠上皮和固有层,或移行到肠黏膜外效应部位。淋巴细胞表达αEβ7整合素,与表达在肠上皮细胞上的E-钙黏素相互作用,介导致敏淋巴细胞移行并定植于肠上皮。淋巴细胞表达的α4β7整合素与表达在肠黏膜固有层扁平静脉上的肠道黏附分子(mucosal addressin cell adhesion molecule-1,MAdCAM-1)相互作用,介导致敏淋巴细胞移行并定植于肠黏膜固有层。表达α4β7的未致敏淋巴细胞还需要在L-选择素(L-selectin)下移行到PP结中。
另外一些淋巴细胞表达α4β7 lowβ1 hi,与不同黏膜效应部位的血管内皮细胞表达的血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)相互作用,介导致敏淋巴细胞移行到诸如支气管腺、泪腺、唾液腺、乳腺等部位发生效应反应,这使不同的黏膜部位的免疫反应相互关联,表明肠黏膜既有局部免疫反应,又有共同黏膜免疫反应。其中黏附分子的表达是局部黏膜免疫反应与共同黏膜免疫反应的分子基础。
关于B淋巴细胞的归巢,有研究显示:表达在小肠上皮细胞的胸腺表达趋化因子(thymus-expressed chemokine,TECK/CCL25)是IgA抗体分泌细胞(antibody secreting cell,ASC)有力的、选择性的趋化因子,能从脾、PP 结、肠系膜淋巴结中高效募集表达趋化因子受体CCR9的IgA ASC到小肠中。另外多种黏膜组织上皮表达黏膜相关上皮趋化因子(mucosaassociated epithelial chemokine,MEC/CCL28),能选择性趋化表达趋化因子受体CCR10 的IgA ASC。MEC趋化肠道和非肠道淋巴组织(包括肠、肺和引流支气管、口腔等部位)淋巴结中的IgA抗体分泌细胞,而不是IgG、IgM抗体分泌细胞,MEC吸引IgA ASC在不同黏膜组织中迁移,解释了在局部黏膜受到抗原刺激后,出现弥散分布的黏膜sIgA免疫反应,是共同黏膜免疫反应的基础。黏膜淋巴细胞归巢能力依赖于抗原再次免疫机体的途径,初次经非胃肠道途径免疫后,归巢受体α4β7和L-selectin表达与再次经非胃肠免疫后归巢受体表达相类似。而初次经口服免疫后,再次口服免疫,归巢受体α4β7与L-selectin具有高表达的特征,这提示肠黏膜记忆/效应淋巴细胞归巢到黏膜和系统免疫的能力取决于抗原再次免疫的途径,深入揭示其分子机制对于研究最有效的黏膜疫苗传递途径是有益的。
2) T/B细胞的活化和分化:
经过淋巴细胞再循环,返回到效应部位的T细胞和B细胞,在不同因子作用下进行分化。初始CD4 +T细胞可分化为效应性T细胞(Th1、Th2、Th17细胞)和调节性T细胞(Th3、Tr1细胞)。其中,IL-12促进Th1细胞发育,IL-4和IL-10促进Th2和Tr1细胞发育,IL-6和IL-23可促进Th17细胞发育。Th1细胞分泌TNF、IFN-γ,活化巨噬细胞和中性粒细胞;Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13,参与清除胞外寄生虫感染、过敏性炎症等;Th17细胞主要分泌IL-17A,清除病原菌和真菌感染;Tr细胞可直接抑制T淋巴细胞、DC细胞和NK细胞的功能,也可通过分泌细胞因子TGF-β和IL-10等抑制免疫反应。
CD8 +T细胞在抗原刺激下可分化成为不同类型的细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells,CTLs)。CTL可特异性直接杀伤靶细胞,主要通过促使细胞裂解和细胞凋亡两种途径发挥作用。CTLs通过TCR与靶细胞表面的抗原肽-MHCⅠ受体复合物结合,在多种黏附分子和受体的相互作用下,与靶细胞紧密接触。接下来,CTLs分泌穿孔素(perforin)、颗粒酶(granzyme)、颗粒溶解素(granulysin)及淋巴毒素(LTα)等物质直接杀伤靶细胞。穿孔素可插入膜内,形成跨膜通道、在细胞膜上构筑小孔,靶细胞膜内外渗透压差明显增高,使水分通过小孔进入胞浆,引起靶细胞涨裂死亡。颗粒酶经穿孔素形成的跨膜通道进入细胞内激活胱天蛋白酶-10(caspase-10),诱导靶细胞凋亡。同时,CTL细胞还可以通过高表达FasL与靶细胞表面的Fas结合,激活胱天蛋白酶-8(caspase-8),导致细胞凋亡。此外,CTL分泌的颗粒溶解素进入靶细胞后,可直接溶解或杀灭靶细胞内的病原体。
CD8 +T细胞也具有分泌细胞因子的作用。其中,Tc1分泌IFN-γ,Tc2分泌IL-4、IL-5 和IL-10。CD8 +T细胞的分化受转录因子T-bet和GATA3调控,IL-12和IFN-γ促进Tc1成熟,而IL-4促进Tc2成熟。另外,还有一种CD8 +T细胞分泌IL-17,也被称为Tc17,还分泌IL-21、IL-22、TNF-α、IFN-γ,表达IL-23R、趋化因子受体CCR6和转录因子RORC2(人)或RORγt(小鼠)。
PP结内的滤泡B细胞受抗原刺激后迁移至MLN发育成熟,经淋巴细胞再循环回到效应部位,成熟为IgA分泌细胞。GALT是产生sIgA免疫应答的主要场所,免疫球蛋白类别转换发生于GALT。GALT中各亚类的T细胞可以与B细胞相互作用,指导免疫球蛋白恒定区重链(conventional heavy-chain,CH)基因转换,这种可指导CH基因转换的T细胞称为“转换”T细胞。转换T细胞可能是CD4 +Th细胞。由于CD4 +Th2细胞在固有层中的数量大于Th1,且能分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10,以及TGF-β,因此Th2可更有效地促进IgA的免疫应答。但有研究发现PP结中免疫诱导部位的Th1或Th2均能诱导IgA黏膜免疫应答。
转换T细胞促进转换,但并不影响B细胞的最终分化以及IgA的合成与分泌。细胞因子可能有助于B细胞的分化和定型。CD4 +T细胞能分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10,以及TGF-β,这些细胞因子诱导B细胞的分化和CH基因的转换。从GALT分离的IgA定型B细胞在体外经IL-6刺激可完成最后的分化。肠上皮细胞在TGF-β的作用下可产生IL-6。在B细胞的成熟过程中,上皮细胞和淋巴细胞相互协调,促进B细胞的成熟。活化的B细胞游走到较远的黏膜组织和腺体后,间质的微环境诱导其最后的分化和定型。
B细胞的最终分化和定型是一个复杂的过程,大致分为三个阶段:①抗原、多克隆丝裂原和超抗原等激活幼稚静息的B细胞,使B细胞进入S期。活化过程中,伴随有MHCⅡ类分子和IL-5受体的表达,这一过程可能发生于GALT的生发中心。②在细胞和细胞因子的作用下,完成重链的重排。③在较远的黏膜组织和腺体,B细胞分化成为IgA浆细胞,同时表达J链蛋白,合成与分泌多聚IgA抗体。
3) sIgA及其介导的黏膜免疫反应:
肠道是sIgA的中枢器官,sIgA是胃肠道和黏膜表面主要的免疫球蛋白,对消化道黏膜防御起着重要的保护作用。肠道sIgA的分泌量远远超过循环中的IgG含量,如此大量的sIgA的形成是在肠黏膜完成的,而不是由血浆中含量甚微的IgA渗透而来。
肠道sIgA主要由肠黏膜中的IgA浆细胞合成分泌,浆细胞首先分泌出聚合IgA,然后与多聚免疫球蛋白受体(pIgR)在上皮屏障的底外表面通过共价键结合形成受体-配体复合物。受体-配体复合物被细胞内吞后,在细胞内发生转运,经蛋白质水解后将仍然带有pIgR N端的IgA分泌至肠腔,这段pIgR片段被称为分泌成分。
除了跨上皮细胞的胞吞作用外,IgA还可通过两种方式进入肠腔。IgA可通过胆管和胆囊的胆道上皮分泌入胆汁,然后经肝胰管壶腹的十二指肠入口进入肠道。IgA进入肠道的另外一种途径是通过婴儿的母乳喂养,母乳IgA与新生儿体内共生菌群结合并限制它在肠道中完全定植。
肠黏膜sIgA的合成分泌受神经、内分泌和免疫系统的调节,肠道黏膜神经内分泌系统调节因子主要包括血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、P物质(substance P,SP)、生长抑素(somatostatin,SS)和细胞因子,其中VIP和SS抑制sIgA合成,SP促进Ig的合成。细胞因子IFN-γ和TNF-α对IgA的分泌有下调作用,IL-4、IL-5、IL-6、IL-10对IgA的分泌有增强和诱导作用,分泌这些因子的细胞主要存在于固有层内,与IgA浆细胞有着密切的空间关系。
sIgA除了前面讲到的参与肠黏膜机械屏障的构成外,sIgA在肠黏膜免疫屏障中发挥着多种多样至关重要的作用。
A. 免疫屏障:存在于肠黏膜表面黏液中的sIgA,可直接分隔食物、病原微生物、毒素等抗原物质与肠上皮细胞的接触,使病原微生物聚集丧失活力,与病原微生物结合使其丧失结合位点等机制,最终达到阻断抗原/病原体与上皮细胞的黏附的目的。
B. 免疫清除:sIgA可与肠腔内的病原微生物相交联形成复合物,刺激肠道杯状细胞分泌大量黏液将sIgA-抗原复合物排出体外。
C. 中和病毒:sIgA不需要补体即可特异性中和病毒,阻止其对宿主细胞的黏附和穿入等,此外sIgA还可通过包裹病毒使其不能吸附于易感细胞,而且,在肠上皮细胞已感染病毒的条件下,在合成分泌的过程中sIgA即可在上皮细胞内中和病毒。sIgA可与毒素形成复合物,防止其与上皮细胞微绒毛结合。
D. 溶解细菌:sIgA可通过激活补体的C3旁路途径,与补体、溶菌酶协同溶解细菌。因此如果临床上使用糖皮质激素、胃肠外营养等进行治疗时,可因为干扰sIgA的合成而引起肠道菌群紊乱,轻则产生脂肪泻为特征的消化吸收障碍,重则发生肠源性感染。
E. 增强细胞毒作用:小肠淋巴细胞可表达sIgA的Fc受体,通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)杀灭病原微生物。
F. 形成口服耐受:sIgA对某些摄入或吸入的食物、空气等抗原具有封闭作用,从而避免产生免疫反应。
G. 不形成炎症:与血清中的IgA不同,sIgA是一种相对非炎症物质,不参与其他免疫球蛋白激活补体或产生抗体所活化的炎症反应,也正是如此,许多抗原因不能有效激活炎症反应而变得无害。
(4) 调节性细胞分泌调节因子:
调节性T细胞,即Treg细胞,在维持肠道免疫耐受及稳态中起着重要作用。肠道提供了独特的利于Treg细胞转化的环境,以使肠道黏膜免疫系统以一种特有的控制方式维持精细的免疫平衡,既能对正常菌群和食物成分耐受、又能对肠道病原体产生有效的免疫应答。Treg细胞包括在胸腺中发育成熟的天然性CD4 +CD25 +FoxP3 +Treg(nTreg)和外周naive T细胞受刺激转化生成的适应性Treg(iTreg):CD4 +CD25 + Treg、Tr1和Th3。有研究认为,iTreg细胞的发育是为了维持肠道的非炎性环境、抑制对环境和食物变应原的免疫反应及减少慢性炎症;而nTreg细胞可预防自身免疫反应和提高所有免疫反应的激活阈值。其具体调节机制详见肠道免疫调节章节的相关内容。
(5) 肠道常见疾病的免疫应答
1) 细菌感染:
肠道常见的细菌感染包括志贺菌、沙门菌及肠致病性大肠埃希菌。由于M细胞的特殊糖萼结构,志贺菌识别M细胞后与之黏附,从滤泡相关上皮的M细胞处突破黏膜上皮,受损的上皮细胞可合成大量的IL-8及募集中性粒细胞对其作出应答,从而影响了上皮之间的紧密连接,造成肠道通透性增高;沙门菌可将宿主上皮细胞的骨架蛋白转化为对自身有利的条件,导致上皮细胞微绒毛退化,包膜形成褶皱后,细菌伴随巨胞饮作用进入细胞;肠致病性大肠埃希菌通过诱导微绒毛的破坏和基架的形成,与宿主发生黏附。被病原体诱导后的上皮细胞、巨噬细胞等对病原体进行处理,递呈给B/T细胞,诱导其分化成为浆细胞/Th、CTL等,进而通过IgA的分泌/细胞毒性作用等清除致病菌。同时,病原体诱导肠道细胞合成的细胞因子和趋化因子可以启动在适应性免疫应答中十分关键的激活级联反应,包括DC细胞成熟、Th1/Th2极化和效应细胞趋化。严重沙门菌感染后可获得免疫记忆能力,这是证明适应性免疫应答在黏膜免疫中发挥作用的经典案例。
2) 炎症性肠病:
炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)的研究中发现其发病与Th淋巴细胞、Treg、DC细胞、NKT细胞、巨噬细胞等免疫细胞相关。首先,大量慢性肠炎模型的研究提示,Th细胞在肠道炎症反应过程中发挥着重要的作用。黏膜T细胞亚群的改变提示反复抗原刺激致使黏膜免疫细胞聚集、激活,其中CD4 +T细胞的激活占优势,进而产生各种细胞因子,引起和放大黏膜炎症。克罗恩病(Crohn's diseas,DC)患者肠道黏膜组织IL-12和IFN-γ的表达升高,体外实验发现IL-12可以通过STAT4途径来诱导Th1反应,因此认为克罗恩病可能由于IL-12启动。溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)患者肠黏膜IL-5、IL-13水平升高,而后者与IL-4共用同一受体,参与Th2细胞的分化和激活,因此认为溃疡性结肠炎与Th2细胞关系密切,但也有研究认为溃疡性结肠炎是Th1与Th2共同作用的结果,在早期可能Th1反应增强,而晚期则以Th2反应占优势。第二,Th17细胞主要分泌IL-17,可被多种细胞因子调节。IBD患者急性炎症期肠黏膜内可以检测到大量IL-17 +的细胞存在,CD患者血清及肠黏膜局部的IL-17水平均高于UC患者,提示Th17也参与了IBD的发病过程。第三,IBD患者体内Treg和FoxP3的表达水平显著低于健康对照者,并且活动期低于缓解期,表明Treg参与了IBD的发生。但也有研究发现随着肠黏膜FoxP3 +细胞数目减少,IBD患者的临床症状有所改善。最后,DC细胞和巨噬细胞等抗原呈递细胞也可以通过分泌IL-6、IL-10、IL-23等细胞因子参与IBD的发生。肠道免疫细胞及细胞因子在IBD中的作用尚未十分明确,多种免疫细胞及细胞因子相互作用构成复杂而精密的网络,共同促进了IBD的发生。
3) 食物过敏:
食物过敏是发生在高敏个体身上的针对特定食源性抗原的免疫介导过程。是由于某种食物或食品添加剂等引起的IgE介导和非IgE介导的免疫反应,而导致消化系统内或全身性的变态反应。食物中的致敏抗原经M细胞处理递呈后,激活PP结内的B细胞,后者经过淋巴细胞再循环后,归巢至肠黏膜固有层,分化为浆细胞,后者产生大量的IgE抗体来中和抗原。其中,少量IgE可与肥大细胞表面的Fc受体结合,固定在这些细胞的表面。当致敏原再次进入体内与胃肠黏膜中的肥大细胞表面的IgE相结合,导致肥大细胞激活脱颗粒,并释放一系列参与过敏反应的炎症介质,如5-羟色胺等,使血管通透性增加,引起Ⅰ型超敏反应。另外,部分抗原物质也可选择性地与IgG +、IgM +、IgA +的浆细胞或T细胞结合,形成免疫复合物,从而引起局部或(和)全身性的Ⅲ型或Ⅳ型变态反应。
四、 肠道的免疫调节
肠道不仅是食物消化吸收的场所,而且还是机体免疫应答的重要器官。当肠道发生功能性或器质性障碍时,不仅影响机体的消化与吸收功能,还会使机体的免疫功能发生失调与紊乱。肠道免疫系统主要由肠道黏膜上皮的免疫相关组织(如派伊尔结、肠系膜淋巴结)、免疫调节细胞(如T细胞、B细胞、树突状细胞和巨噬细胞)和相关的免疫调节分子(白介素-22、白介素-6)等组成,它们共同构成一道免疫屏障,及时地识别外来微生物抗原、食物抗原以及自身异常抗原,诱导局部和全身性的免疫应答反应。肠道同时也是机体进行固有免疫和适应性免疫的重要场所,并与肠道化学屏障、机械屏障和生物屏障共同构成一个完整的肠道屏障,保护肠道免受外来的抗原破坏和免遭异常的免疫应答反应。肠道免疫受机体多种因素调节,本章节从肠黏膜免疫细胞、免疫调节因子、营养物质和神经内分泌四个方面介绍参与肠道免疫调节的相关机制(图2-11)。
图2-11 肠道的免疫调节
1. 肠道免疫细胞的免疫调节
(1) T细胞亚群的肠道免疫调节作用:
T细胞对肠黏膜屏障的调节主要表现在辅助性T细胞(Th细胞)的调节,根据辅助性细胞分泌细胞因子的类型将其分为Th1、Th2和Th0。Th1细胞主要分泌干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和白介素-12(interleukin-12,IL-12),介导细胞免疫和局部炎症反应,对清除细胞内病原体起重要作用;Th2细胞主要合成分泌白介素-4 (IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-10(IL-10)和白介素-13(IL-13),主要辅助B细胞增殖和抗体生成,与抗体介导的体液免疫应答反应有关,对清除游离的病原体发挥重要作用。目前的研究普遍认为肠道炎症是由于打破Th1与Th2细胞间的平衡而引起的细胞因子反应。早期的研究认为克罗恩病(Crohn's disease,CD)与溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)可能是分别由Th1细胞(通过如IFN-γ和IL-12)与Th2细胞(通过如IL-4)介导的细胞因子反应。然而随后的研究发现,给予克罗恩病患者及结肠炎小鼠使用IFN-γ抗体治疗并未达到满意的疗效,而使用IL-12p40的抗体中和IL-12和IL-23 后,对处于活动期的克罗恩病患者及结肠炎小鼠有明显的治疗效果。
最近研究发现了一类占辅助性T细胞1/3的分泌白介素-17(IL-17)的Th17细胞,Th17细胞在IL-6和TGF-β的诱导下可表达转录因子维A酸相关孤儿受体γt(RORγt),RORγt作为“主调节器”能进一步增加Th17细胞对IL-23的反应性。与健康人相比,克罗恩病患者黏膜固有层内Th1细胞与Th17细胞的数量增加,提示与传统的Th1细胞信号通路相比,Th17细胞相关的IL-23—IL-17轴对克罗恩病的发展起重要作用。 Tcr α基因敲除的小鼠使用 唑酮诱导结肠炎后,增加Th2细胞的免疫应答反应能加剧克罗恩病的进程。最新的研究鉴定出的一群天然辅助细胞(nature helper cells),这群细胞是一类脂肪相关的淋巴细胞簇,在克罗恩病的发病过程中,天然辅助细胞能持续产生大量Th2型细胞因子(如IL- 13和IL-5),并帮助B1细胞维持对IL-33、IL-2和IL-25的反应性。
(2) 调节性T细胞下调肠道免疫应答:
由于Th1和Th17细胞的过度反应可能引起肠道炎症,因此机体在正常状态下,为了维持肠道内环境稳定,具有致病能力的效应T细胞受肠道多种细胞的严格调控。在肠道适应性免疫系统中,与辅助性T细胞相比,调节性T细胞(Treg细胞)优先被诱导分化。大约二十年前,CD4 + CD25 + Treg细胞最初在研究对自身和非自身抗原维持免疫耐受时发现。CD4 + CD25 + Treg细胞亚群通过产生抗炎的细胞因子IL-10和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)抑制炎症反应,同时CD4 + CD25 + Treg细胞通过表达淋巴细胞活化的淋巴细胞激活基因-3(lymphocyte activation gene-3,LAG-3)、CD39 (cluster of differentiation 39)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associatedantigen-4,CTLA-4)和Nrp-1(neurophilin 1)抑制抗原呈递细胞的功能。
目前认为转录因子FoxP3(fork head box p 3)是调控调节性T细胞的主要调节因子。FoxP3 + Treg细胞能抑制包括CD4 +、CD8 + T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞在内的多种免疫细胞的增殖与活性。FoxP3 +Treg细胞需要至少经由T细胞抗原受体(TCR)的刺激与IL-2和TGF-β的存在才能诱导产生。IL-2信号通路激活信号转导和转录活化蛋白5(signal transduction and activator of transcription 5,STAT5),从而启动FoxP3 +Treg细胞的发育。此外,TGF-β通过与FoxP3的增强子元件STAT3及活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)共同作用促进FoxP3的转录。FoxP3功能基因的突变会引起IPEX综合征(免疫功能失调、多发性内分泌腺病、肠病及X染色体连锁综合征)。目前已经提出多种机制解释FoxP3 + Treg细胞的免疫抑制作用。其中一种机制认为FoxP3 + Treg细胞是通过产生具有抗炎作用的细胞因子实现的,并已有研究证实,肠道FoxP3 +Treg细胞能通过产生大量的IL-10维持肠道内环境的稳定。同时,最新的研究表明,调节性T细胞能以依赖IL-10的方式抑制炎症,并预防炎症性肠病(IBD)的发生。此外,调节性T细胞分泌的IL-10可以调节肠髓系细胞的活性。
此外,TGF-β也参与了调节性T细胞介导的免疫抑制作用。在由于T细胞转移引起的结肠炎小鼠中,使用抗TGF-β的药物可以阻止调节性T细胞介导的抗炎作用。在同种动物模型中,CD45RB high细胞由于其TGF-βⅡ型受体功能的缺陷,因此不能对TGF-β产生反应,即不能表现出由调节性T细胞介导的免疫抑制。另一种可能参与调节性T细胞调节的分子是腺苷,腺苷是一种具有抗炎功能的核苷酸。给予结肠炎小鼠腺苷的激动剂可减少小鼠肠道炎症的发生,但不能缓解腺苷受体缺陷小鼠的肠道炎症。此外,白介素-35(IL-35)与白介素-2(IL-2)可能也参与到由调节性T细胞介导的免疫抑制。体外研究发现IBD患者的效应性T细胞参与调节性T细胞介导的免疫抑制,可能是因为IBD患者黏膜细胞表达高水平的Smad7(Smad family member 7),而Smad7对TGF-β信号通路起抑制作用。给予IBD患者Smad7的反义寡核苷酸能恢复由调节性T细胞诱导的免疫抑制。
(3) 其他参与肠道免疫调节的免疫细胞
1) B细胞参与肠道多种免疫调节:
大部分定位于小肠绒毛的B细胞是来源于骨髓的B220 +IgM +IgD +的传统B2细胞,另一些也具有分泌IgA能力的IgM -IgD +B细胞定位更接近小肠上皮。这些B细胞可能具有表达激活诱导胞啶脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)的能力,并且能与固有层的树突状细胞相互作用。有研究报道在无菌小鼠或Toll样受体(TLR)信号通路缺陷的小鼠固有层中B220 +IgM +B细胞的数量更多,提示固有层B2细胞可能不具有监测肠道微生物变化的功能。然而另有研究报道在无菌小鼠和TLR缺陷小鼠中固有层B220 +IgM +B细胞和B220 -IgM +浆细胞的数量及IgA的水平均显著降低。以上结果提示,B220 +IgM +IgD +数量的增加对于固有层募集B2细胞不是必需的,而是由于IgM +B细胞向产IgA细胞的分化的减少导致的,而肠上皮细胞内的TLR信号通路对于促进IgM +B细胞向固有层募集及转化成IgA +B细胞起重要作用。
幼稚骨髓来源的B2细胞在固有层中的表达严格依赖于淋巴毒素α(lymphotoxin α,LTα)及核因子-κ B(NF-κ B),NF-κ B是由肠道基质细胞中的淋巴毒素βR(lymphotoxin βR,LTβR)及核因子-κ B诱导激酶(NF-κ B-inducing kinase,NIK)激活产生的。LTα、LTβR基因敲除的小鼠和 aly/aly小鼠(NIK基因自然突变小鼠)的固有层完全缺乏B细胞,同时它们的肠道中不存在IgA浆细胞。使用正常骨髓细胞重构的 aly/aly小鼠肠道中仍然不存在B细胞及IgA浆细胞。另一种幼稚的B2细胞可能包含一些从派伊尔结或孤立淋巴滤泡转移到固有层的IgM +B细胞。与普通的幼稚IgM +B细胞不同,这些B细胞的迁移不依赖表达NIK的固有层基质细胞。研究发现, aly/aly小鼠的幼稚骨髓来源的B220 +IgM +B细胞在经历一个正常的肠道环境后可以迁移到黏膜固有层。
还有一类B细胞是在某些特定条件下能转化为IgA浆细胞的腹膜B1细胞。腹膜B1细胞是一个具有IgM hiIgD lowB220 lowMac1 int表型的B细胞。表面表达CD5亚群的B1细胞称为B1a细胞。此外,腹膜B1细胞能表达高水平的α 4整合素、α 6整合素、β 1整合素和CD9。在急性肠道炎症情况下,B1细胞通过TLR信号通路下调整合素的表达并激活G蛋白偶联受体使其转移出腹膜,并通过大网膜重新定位于肠道固有层,发挥相应的生理学功能。
调节性B细胞(B reg),如CD1d high存在于肠道相关淋巴组织中,负责协调适应性免疫系统。调节性B细胞表达的CD1d对于IL-10的生成至关重要,并起到抑制炎症级联反应的作用。因此,CD1d缺陷的调节性B细胞不能抑制肠道炎症。多项研究表明,调节性B细胞在适应性免疫系统通过IL-10维护肠道免疫平衡,抑制肠道炎症。
2) 树突状细胞与巨噬细胞的肠道免疫调节作用:
树突状细胞(DC细胞)和巨噬细胞在健康黏膜的固有层大量存在,它们之间的相互作用及其在肠道炎症发生发展中的作用越来越受到关注。小鼠肠黏膜固有层的巨噬细胞可能具有抗炎的作用,而树突状细胞可能具有促炎作用。树突状细胞缺乏整合素αvβ8的小鼠能在TGF- β 1的激活下发生自发性结肠炎。树突状细胞缺乏β链蛋白的小鼠由于不能识别Wnt配体的表型改变,因此在硫酸葡聚糖诱导的结肠炎模型中,与对照小鼠相比表现为更严重的结肠炎症。
根据树突状细胞激活T细胞的种类及功能不同,小鼠肠道中的树突状细胞主要分为两类:诱导Th1和Th17的CD11b +的树突状细胞和调控调节性T细胞分化的CD103 +树突状细胞。其中CD103 +树突状细胞也能诱导T细胞和B细胞定位于肠道。目前提出一个基于谱系的新分类:一类是能与Flt3结合的来源于普通单核细胞、树突状细胞前体和pre-树突状细胞的CD103 +CX3CR1 -细胞,另一类是来源于Ly6 low单核细胞的CD11b +CD14 +CX3CR1 +细胞。CX3CR1 -细胞表达高水平的共刺激分子(如CD70、CD80和CD86)产生大量的TNF-α,提示其可能激活效应T细胞。口服抗原激活CX3CR1 -细胞后,CX3CR1 -细胞迁移到附近的淋巴结,将抗原呈递给T细胞,同时CX3CR1 -细胞也能启动调节性T细胞的分化,因此CX3CR1 -细胞作为调节性T细胞的负调控因子,维持肠道微环境稳定。树突状细胞能通过大量的细胞内及膜受体识别原核及低等真核生物表面的保守序列,其中最具有代表性的是TLR,在肠道相关淋巴组织中,树突状细胞也可以通过不依赖Toll样受体的方式激活。
小鼠肠道还有大量表达F4/80 +的成熟巨噬细胞,这些细胞都位于固有层中,在与上皮紧密接触,并表达CD11b。在小鼠的派伊尔结内也有少量F4/80 +巨噬细胞表达。由于巨噬细胞不停的吞噬颗粒性抗原和细菌,因此巨噬细胞可能是通过清除转运到上皮内的抗原以维持肠道内环境的稳定。肠道巨噬细胞表达低水平的共刺激分子(CD40、CD80和CD86)和主要组织相容性复合物Ⅱ(MHCⅡ)。与血单核细胞或存在于其他组织的巨噬细胞不同,肠道巨噬细胞在TLR配体、细菌及INF-γ的刺激下不会产生炎症细胞因子。这与巨噬细胞TLR的表达减少和巨噬细胞必需的功能性受体(CD14、人FcγR1和FcγRⅢ、补体受体3和4)活化能力的降低有关。此外,肠道巨噬细胞不表达受TLR信号通路调控的下游分子。同时,正常的胃肠组织富含脱敏巨噬细胞(如IL- 10)或抑制巨噬细胞活化的分子(如前列腺素E 2、TGF-β 1)。因此肠道的巨噬细胞保持部分活化状态,使它们能够吞噬和清除微生物,维护肠道内环境的稳定。肠道巨噬细胞也可以抑制肠道免疫调节,小肠F4/80 +CD11bCD11c dull巨噬细胞样细胞可以在体外诱导调节性T细胞分化;F4/80缺陷的小鼠CD8 +Treg细胞的数量大大减少,且此种小鼠喂食蛋白抗原不能发展为口服耐受。
3) 肠道上皮细胞的肠道免疫调节作用:
近年来的研究表明,肠道上皮细胞具有重要的黏膜免疫调节功能,其可产生大量细胞因子如IL-6、IL-7、TGF-β等,其中IL-6和TGF-β可以促进脂多糖(LPS)诱导的B细胞分泌IgA,也可以诱导IgM向IgA进行类别转换;IL-7与其受体结合可调节肠黏膜淋巴细胞的生长发育;TGF-β同时也是负向免疫调节因子,在肠黏膜淋巴细胞接触食物、化学抗原等时,降低免疫反应避免损伤黏膜。此外,肠道上皮细胞自身也能合成和分泌趋化因子和细胞因子,上皮细胞也表达天然免疫模式识别受体(如膜表面的Toll样受体和胞质内Nod受体),从而调节黏膜对抗原的反应。如人类Toll样受体家族有10位成员,TLR4识别革兰氏阴性细菌脂多糖分子,TLR2识别细菌脂蛋白、肽聚糖、胞壁酸等,TLR9识别细菌上没有甲基化的DNA,TLR5识别细菌鞭毛蛋白质等。Nod家族识别进入胞质内的病原体抗原,如病原体或其抗原通过吞噬进入细胞内,Nod能够及时识别诱导免疫反应。另外,肠上皮细胞距离固有层B细胞很近,它能够通过分泌一系列细胞因子影响局部抗体的产生。肠上皮细胞是抑制性CD8 +T细胞被激活的主要部位,固有层淋巴细胞和树突状细胞以及肠上皮细胞相互作用是控制炎症的重要因素。肠上皮细胞能够表达与肠腔内抗原加工有关的调节分子,由于抗原结合肽太小,因而其对CD8 +T细胞的激活优先于CD4 +T细胞,在正常情况下,表现对肠腔内抗原的耐受。同时,肠上皮细胞本身具有抗原呈递作用,肠上皮细胞能够激活CD8 +T细胞。
2. 参与肠道免疫调节的调节分子
(1) 白细胞介素
1) 白介素-22:
白介素22(IL-22)是与IL-10及IL-10细胞因子家族的其他成员(IL-19、IL-20、IL- 24和IL-26)高度同源的一种分泌型细胞因子。IL-22是第一个发现的激活的T细胞产物,并且随后发现IL-22是由CD4 +Th17细胞分泌的标志性细胞因子,因而认为IL-22主要介导适应性免疫,同时也另有研究认为IL- 22参与肠道的固有免疫。IL-22可由固有免疫细胞或Th17细胞产生,其中肠道上皮细胞对IL-22尤其敏感。IL-22的受体是一个异二聚体,由一种广泛表达的IL-10R2亚基(其也可用于其他细胞因子受体)和特定的IL-22R1亚基组成,IL-22R1亚基仅在结肠和小肠上皮细胞、肝细胞、上皮下成纤维细胞中表达,而在T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞不表达该受体亚基。在如LPS、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎症因子的作用下,肠上皮细胞内IL-22R1亚基的表达上调,而IL-10R2亚基的表达未发生变化。IL-22与其受体结合后激活其下游分子STAT3,诱导上皮细胞生成β-防卫素、急性期蛋白以及其他炎症介质,促进上皮的损伤修复。在结肠上皮下成纤维细胞中,IL-22能刺激基质金属蛋白酶和趋化细胞因子的表达。
除了针对特定肠道病原体的宿主防御,IL-22在调节肠道炎症反应中也起着一定的作用。克罗恩病和溃疡性结肠炎患者的肠道组织及血清中IL-22表达水平增加。在肠道炎症的小鼠模型中,尤其是Th1细胞诱导的结肠炎小鼠模型中,IL-22的水平显著增加。使用IL-22抗体能加剧由DSS诱导的结肠炎,而过表达IL-22则可以改善结肠炎症状。CD4 -T细胞转移的结肠炎模型中,IL-22能控制炎症的发展。有趣的是,由转移的T细胞产生的IL-22和黏膜NK细胞产生的细胞因子共同保护黏膜抵抗炎症,进一步明确了IL-22的功能受适应性和固有免疫细胞两方面的调节。以上结果提示,IL-22作为关键的保护因子在肠道微生物感染和炎症过程中对肠黏膜起保护作用。
2) 白介素-6:
在二十年前,白介素-6(IL-6)及其亚家族成员IL-11、IL-27、抑瘤素M及白血病抑制因子最初被认为是B细胞的活化和分化因子,但随后的研究发现,IL-6是一种多效性的细胞因子,影响许多其他免疫活动,包括造血、维持内环境稳定以及神经内分泌等生理过程。IL-6可以由抗原呈递细胞(树突状细胞、巨噬细胞和B细胞)和CD4 +T细胞生成,在肠道内,IL-6也可由肠上皮细胞和肌成纤维细胞分泌产生。TNF-α、LPS、IL-1和腺苷均能诱导IL-6的生成,并通过激活下游的转录因子:核因子-κ B(NF-κ B)、cAMP反应元件结合蛋白、CCAAT /增强子结合蛋白和激活蛋白-1等发挥生理学效应。
IL-6可以通过多种方式参与机体适应性免疫,其中包括促进T细胞和树突状细胞之间的相互作用和增强T细胞的存活。最新的研究认为IL-6也能通过参与Th17辅助性T细胞的发育参与机体适应性免疫。IL-6基因敲除的小鼠表现为肠道缺乏Th17细胞,提示IL-6对促进此种效应性T细胞亚群的发育起重要作用。已有研究报道,IL-6不仅可以促进机体的炎症和适应性免疫反应,IL-6也可以通过阻止肠上皮细胞凋亡及增强黏膜屏障的修复抑制肠道炎症。IL-6基因敲除的小鼠在柠檬酸杆菌感染后表现为更强的炎症反应,而此种小鼠使用DSS诱导后,与对照组相比,也表现为严重的急性结肠炎。另一项最近的研究表明,IL-1受体信号通路缺失的小鼠在柠檬酸杆菌感染后不能产生IL-6,与IL-6缺失的小鼠表型类似,此种小鼠也表现为更严重的黏膜溃疡和上皮屏障通透性增加。IL-1对IL-6产生的扩增效果亦在对金黄色葡萄球菌的皮肤免疫反应中得到证实。以上结果提示,应用IL-6阻断剂用于治疗克罗恩病时,可能会使患者肠黏膜对有害微生物及内环境的破坏更为敏感。
(2) 信号转导与转录激活因子3:
IL-22和IL-6在结构上的同源性较小,但是它们能共同通过一些信号转导通路发挥生物学效应,它们都能磷酸化转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)并使之二聚化易位进入细胞核。STAT3可以被多种细胞因子激活,包括表皮生长因子、肝细胞生长因子、IL-10及IL-6的成员细胞因子家族(如IL-11,抑瘤素M和白血病抑制因子),并且许多肠道内能激活STAT3的细胞因子(如IL-22和IL-6)均具有黏膜保护功能。在HLA B27的转基因大鼠中给予IL-11后能减轻结肠炎症;含有表皮生长因子的灌肠剂能显著改善中度左半溃疡性结肠炎患者的临床症状;在DSS诱导的小鼠肠黏膜局部表达肝细胞生长因子,能降低此种小鼠的结肠炎症。
在最新的全基因组关联研究中,STAT3单核苷酸多态性被确定为是克罗恩病和(或)溃疡性结肠炎一个独立危险因素。结肠炎患者的肠道炎症部位的T细胞和上皮细胞均表现为STAT3的激活,并且患者外周血与结肠STAT3的激活水平与患者的炎症水平高度相关。另一项最新研究显示,由于IL-10受体突变使得STAT3的活化受到抑制,可能与早发性IBD的发展有关。这些临床研究表明STAT3在IBD的发展中发挥着重要的致病性的作用。
虽然已经明确STAT3在上皮细胞和髓样细胞中具有黏膜保护作用,但当STAT3在T细胞等其他细胞中被激活也会引起黏膜炎症。之前的研究发现,使用IL-6受体的中和抗体能通过诱导固有层T细胞凋亡,抑制Th1依赖的实验性结肠炎的进展,IL-6能通过STAT3抑制T细胞凋亡。同时黏膜免疫系统与共生细菌可以通过STAT3相互作用,细菌感染能激活STAT3在结肠上皮细胞及浸润的免疫细胞中表达,并触发Th17诱导的黏膜免疫应答。
(3) Smad:
由肠上皮细胞、髓样细胞和淋巴细胞分泌的TGF-β在维持肠道内环境的稳定中起重要的作用,而TGF-β作用的发挥主要是通过自分泌或旁分泌的方式激活转录因子Smad(因与线虫Sma及果蝇Mad蛋白同源而得名)实现的。Smad信号通路一方面可以通过调节B细胞产生IgA,保护肠黏膜屏障;另一方面可以调节CD4 +T细胞的平衡及分化成炎症Th17细胞,并抑制FoxP3 +调节性T细胞的激活。病原微生物激活Smad蛋白后能唤起保护性炎症免疫反应,活化的Smad与如维生素A的代谢产物维A酸等免疫调节因子协同作用,使机体对共生微生物和无害食物抗原产生免疫抑制。这一系列功能是通过TGF-β与不同的Smad亚型共同作用实现的。
临床研究发现,克罗恩病患者的Smad7表达水平增加,而Smad3磷酸化水平降低。同时从健康人分离得到的功能性调节性T细胞不能抑制克罗恩病患者的CD4 +T细胞,增加Smad7的表达后,可以逆转这一结果。在小鼠中异位表达Smad7也观察到了与人类炎症状态相似的结果,即Smad7可以在调节性T细胞中抑制TGF-β信号通路。TGF-β也可以通过激活Smad2调控整合素αEβ7(CD103)直接影响T细胞的归巢。Smad2基因敲除的小鼠表现为B细胞数量增多,但是分泌IgA的含量减少;Smad7基因敲除的小鼠则表现为B细胞数量减少,而产生的IgA增加,同时受TGF-β激活的Smad2的磷酸化水平降低。
(4) 核因子-κ B:
在克罗恩病患者结肠中可观察到大量的肠上皮细胞凋亡,使用TNF的抗体干预后,细胞凋亡减少,这一结果提示病原微生物可能是通过加速上皮内淋巴细胞(IECs)的凋亡进而穿过黏膜上皮屏障,同时过度活化了黏膜内的免疫细胞,诱发急性和慢性的炎症反应。核因子-κ B(NF-κ B)作为IECs的内源性抗凋亡分子,抑制肠上皮细胞的凋亡。小鼠IECs细胞缺乏IKKγ(NF-κ B调控因子)表现为自发性结肠炎,同时也在IKKγ缺陷的上皮细胞中观察到了凋亡的增加;上皮细胞特异性敲除TAK1(IKK的上游调控因子)也表现为自发性肠炎。IECs细胞IKKγ缺失会使细菌进入肠道组织,随后细菌激活黏膜的免疫细胞产生大量的炎性细胞因子,进一步破坏上皮屏障系统。
单个免疫球蛋白IL-1R相关受体(single immunoglobulin IL-1R-related receptor,SIGIRR)属于IL-1/TLR超家族成员,其可以抑制由于肠上皮屏障损伤及细菌浸润所引起NF-κ B的过度激活。 Sigirr基因敲除的小鼠在DSS的诱导下出现严重的结肠炎症,在此种小鼠中,NF-κ B与JNK信号通路持续被激活,补充SIGIRR后肠道炎症得到缓解,同时使用抗生素去除病原细菌后,异常激活的NF-κ B恢复正常。A20是另一个NF-κ B的负调控因子,并认为是克罗恩病发病的易感基因。IECs细胞缺失A20会更易被DSS诱导发生结肠炎症。以上结果提示NF-κ B一方面可以抑制IECs细胞凋亡,另一方面IECs细胞中NF-κ B的过度激活促进肠道炎症的发生,同时NF-κ B 的双重作用受病原微生物的调控。
3. 调节肠道免疫的营养物质
(1) 短链脂肪酸:
膳食多糖和内源性黏液在肠道被消化和细菌代谢成短链脂肪酸:乙酸酯、丁酸酯和丙酸酯。这些短链脂肪酸上皮细胞的能量来源同时也影响着免疫细胞功能。乙酸酯和丁酸酯能通过刺激黏蛋白的释放和维持上皮完整性等方面维持良好的上皮屏障功能。乙酸酯和丁酸酯还能调节上皮细胞的增殖并促进上皮细胞分泌细胞因子。短链脂肪酸能通过激活G蛋白偶联受体(GPR41和GPR43)及抑制组蛋白去乙酰化,影响肠道淋巴细胞和肠上皮细胞的免疫调节。乙酸酯能通过促进中性粒细胞表达的G-蛋白偶联受体43 (GPR43),调节中性粒细胞的免疫功能。缺乏GFR43的中性粒细胞吞噬能力和产生活性氧的能力下降,同时对趋化因子和炎症趋化因子的敏感性增加,GPR43缺陷的小鼠也表现出肠道炎症的加剧。短链脂肪酸可以诱导淋巴细胞产生多种细胞因子(TNF-α、IL-2、IL-6和IL-10)和趋化因子(如MCP-1和CINC-2)调节淋巴细胞的功能。短链脂肪酸也能调节淋巴细胞迁移到炎症病灶并摧毁微生物病原体。
(2) 维生素:
机体的维生素来源于饮食和共生细菌的代谢。目前已有证据表明维生素参与了调节上皮免疫反应。维生素A的代谢产物视黄酸参与诱导调节性T细胞和抑制Th17细胞活性的免疫过程。视黄醛脱氢酶是将维生素A转化为视黄酸的关键酶,而肠道内的肠上皮细胞和树突状细胞是主要表达视黄醛脱氢酶的两种细胞,这提示,同时具有上皮细胞、树突状细胞和维生素A的独特肠道环境对于优先诱导调节性细胞进而维持免疫耐受是至关重要的。已有研究报道调节性细胞对于增强的IgA 1B细胞在肠中分化起重要作用;同时视黄酸能诱导肠归巢分子(CCR9和α4β7整合素)在产IgA的B细胞和T细胞中表达,这提示视黄酸可以通过直接与间接两种方式增加肠道IgA的免疫应答。
另一个重要的维持调节性T细胞的维生素是维生素B 9。维生素B 9受体(叶酸受体4)仅在调节性T细胞表面表达,因此可以作为调节性T细胞的表面标志物。最新的研究发现,维生素B 9是调节性T细胞存活必不可少的分子。调节性细胞从幼稚T细胞分化的过程中,如缺少维生素B 9,调节性T细胞则不能存活。维生素B 9可以来源于饮食和共生菌,因此维生素B 9主要由空肠和十二指肠的上皮细胞吸收,膳食中吸收的维生素B 9的减少将导致小肠中调节性T细胞的减少。
(3) 脂类:
食物中的脂类也参与了肠道的免疫调节。ω-3多不饱和脂肪酸与ω-6多不饱和脂肪酸的比率可确定炎症的存在和(或)炎性水平。食物中的亚油酸是ω-6多不饱和脂肪酸的前体,并且能经过代谢合成前炎症脂质信号分子;而来源于亚麻酸的ω-3多不饱和脂肪酸则被机体代谢成抗炎的脂质信号分子。这可能是由于ω-3多不饱和脂肪酸通与巨噬细胞表达的GPR120结合,从而抑制炎性细胞因子的产生,发挥抗炎作用。
具有重要的免疫功能的另一脂质代谢产物是鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine 1-phosphate,S1P),鞘氨醇-1-磷酸能调控细胞转运、活化和存活。与其他组织相比,肠道中含有包括鞘氨醇-1-磷酸在内的较高水平的鞘脂,肠道中鞘脂的来源主要是饮食,尤其是来源于肉类、奶类、蛋类和鱼类中的鞘磷脂。由于肠上皮细胞中表达的能将饮食中的鞘磷脂分解为神经酰胺和鞘氨醇的碱性鞘磷脂酶和神经酰胺酶,同时也表达将神经酰胺和鞘氨醇转化为鞘氨醇-1-磷酸的关键酶(如鞘氨醇激酶),因此,肠上皮细胞可能是通过产生神经酰胺、鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸调节肠道的免疫反应。
4. 调节肠道免疫的神经内分泌系统
神经内分泌系统也参与肠道黏膜免疫的调节过程。中枢神经系统可通过体液激素机制调节内毒素的全身性炎症反应。内毒素和细胞因子能促使穿入迷走神经纤维向大脑发放冲动,以刺激下丘脑-垂体-肾上腺的抗炎反应。乙酰胆碱作为迷走神经纤维的主要递质,在体外能够显著降低人巨噬细胞被内毒素激活后TNF-α、IL-1、IL-6、IL-18的释放,而对抗炎症因子IL-10的分泌没有显著影响。在大鼠体内诱发致死性内毒素血症后,直接用电刺激其外周迷走神经纤维能抑制肝脏合成TNF-α,降低血浆TNF-α的浓度峰值,阻止内毒素休克的发生。甘丙肽是一个30个氨基酸的神经肽,分布于神经系统和胃肠道上,分泌型腹泻是由于甘丙肽1受体的表达上调且发生激活的结果。各种神经递质和脑肠肽等也可直接或间接影响机体的免疫。
(吴哲 张凤 周建华 迟毓婧 陈宁)
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