第一节 细菌学诊断实验
一、 分枝杆菌涂片检查
（一）涂片
1.直接涂片法
（1）使用干燥、清洁的新载玻片制备涂片。在玻片一端的1/3处注明标本序号。确保玻片上的编号与痰盒的编号相同。
（2）用折断的竹签挑取痰标本或脓液标本中干酪样、脓样等部分，以画同心圆或发卷的方式均匀涂抹成10mm×20mm大小的卵圆形痰膜。注意：透过痰膜看报纸上的5号字时，字迹较模糊为适宜厚度，看不见或很清晰表明痰膜过厚或过薄。
（3）玻片置于染色架上，痰膜朝上静置，室温自然干燥。用酒精灯加热固定。注意：不要在火焰上静止不动或加热时间过长，造成痰膜焦化，5秒内来回烘烤4次即可。
2.离心沉淀涂片法 将前处理液化后的痰标本、胸腔积液、腹水或脑脊液、尿液、支气管肺泡灌洗液等标本3000g离心20分钟，取沉淀涂片，方法基本与上同。
（二）染色与镜检
1.抗酸染色法（萋-尼染色Ziehl-Neelsen stain）
（1）技术原理：分枝杆菌细胞壁内含有大量的分枝菌酸等脂类物质，耐受多种酸性递质的作用，革兰染色等普通的染色方法不易着色。高浓度碱性复红溶液与分枝菌酸结合形成复红-分枝菌酸复合物，能够抵抗稀酸的漂洗，因此能够保持紫红色，而背景中的其他细胞细菌等则被复染为蓝色。
（2）显微镜：具有100倍油镜和8～10倍目镜的双目显微镜。
（3）试剂配置
①初染液：10ml经定性滤纸过滤的碱性复红储存液（8g碱性复红溶于95%乙醇溶液100ml中）加入90ml 5%苯酚溶液，充分振荡，混合均匀后，使用定性滤纸过滤，置于避光试剂瓶中。
②脱色液：将50ml浓盐酸沿着瓶壁缓慢倒入950ml 95%乙醇中，搅拌均匀。
③复染液：以蒸馏水5倍稀释0.3%亚甲蓝储存液（0.3g 亚甲蓝溶于50ml 95%乙醇中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml），充分振荡混匀，用定性滤纸过滤即得0.06%的亚甲蓝复染液。
（4）染色步骤
①初染：在已火焰固定的涂片上滴加初染液，盖满涂片标本而不溢出载玻片为宜，在火焰上方徐徐加热至出现蒸气，但不要沸腾，脱离火焰，保持5分钟，染色期间保持痰膜被染色液覆盖，避免干燥，必要时可续加染色液。流水自玻片一端缓慢冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
②脱色：自一端滴加脱色液，布满玻片，脱色1分钟，流水冲洗；如有必要，可重复滴加脱色液，脱至无可视红色为止。
③复染：滴加复染液，布满玻片，染色30秒，流水冲洗。涂片干燥后镜检。
（5）镜检与报告：在涂片上滴加镜油后用光学显微镜油镜检查。在淡蓝色背景下，只有抗酸杆菌染成红色。
报告标准如下。
①抗酸杆菌阴性：连续观察300个视野，未发现抗酸杆菌。
②报告抗酸杆菌数目：1～8条/300视野。
③抗酸杆菌阳性（1+）：3～9条/100视野。
④抗酸杆菌阳性（2+）：1～9条/10视野。
⑤抗酸杆菌阳性（3+）：1～9条/视野。
⑥抗酸杆菌阳性（4+）：≥10条/视野。
如果观察时发现抗酸杆菌分布不均匀，一个可行的办法是估计所有视野菌的总数再平均观察到的视野数。报告（3+）和（4+）时至少观察50个视野。
2.荧光染色法
（1）技术原理：抗酸菌菌体经金胺O染色后，经蓝色光源照射激发，在高锰酸钾复染的暗色背景下呈现黄绿色荧光。
（2）显微镜：荧光显微镜
（3）试剂配制
①初染液：0.1%的金胺O溶液（金胺O 1g，苯酚50ml，乙醇100ml，蒸馏水至1000ml）。
②脱色液：将50ml浓盐酸沿着瓶壁缓慢倒入950ml 95%乙醇中，搅拌均匀。
③复染液：0.5% 高锰酸钾水溶液。
（4）染色步骤
①初染：滴加初染液，盖满玻片，染色15分钟。流水自玻片一端轻缓冲洗，洗去染色液，沥去玻片上剩余的水。
②脱色：滴加脱色液，布满痰膜，脱色3分钟或至无色。流水轻冲洗。
③复染：滴加复染液，染色2分钟，沥去复染液，自然干燥，准备镜检。
（5）结果判读
读片方法：首先以×10目镜、×20物镜进行镜检，发现杆状荧光颗粒时，使用×40物镜确认。在暗背景下，抗酸杆菌发出黄色杆状荧光。
报告标准如下。
①抗酸杆菌阴性：连续观察300个视野，未发现抗酸杆菌。
②荧光染色抗酸杆菌阳性（报告抗酸杆菌数目）：1～3条/50视野。
③荧光染色抗酸杆菌阳性（1+）：10～99条/50视野。
④荧光染色抗酸杆菌阳性（2+）：1～9条/视野。
⑤荧光染色抗酸杆菌阳性（3+）：10～99条/视野。
⑥荧光染色抗酸杆菌阳性（4+）：≥100条/视野。
如果观察时发现抗酸杆菌分布不均匀，一个可行的办法是估计所有视野菌的总数再平均观察到的视野数。报告（3+）（4+）时至少观察20个视野。
（三）质量控制
1.假阳性结果的原因
（1）棒菌属、诺卡菌属、玫瑰红球菌属和一些细菌孢子、酵母都存在程度不同的抗酸染色性。
（2）环境分枝杆菌，尤其是实验室用水中的环境分枝杆菌，可能污染水洗涤过程，干扰检查结果。
（3）食物残渣；木、棉纤维等。
（4）标本或涂片之间的污染。
2.假阴性结果的原因
（1）留取的标本质量不合格。
（2）未挑选标本的适当部分涂片。
（3）不正确的涂片、染色和读片操作，如：痰膜过薄，加热固定过度，初染时间过短或加热过程沸腾，复染过度，读片视野不足等。
（4）读片人员色弱或其他视觉障碍。
3.室内质量控制 室内质量控制指实验室内部的操作规程、设备和耗材、痰标本收集、染色剂制备、涂片制备和染色、显微镜维护、显微镜镜检、结果登记和报告以及痰片保存等整个过程的内部检查和监测。
（1）痰标本收集
①容器：采用可密封的螺旋盖收集痰标本，标明患者信息和编号。
②痰标本性状：干酪痰、脓痰、血痰和黏液痰为合格标本，唾液和口水为不合格标本。
③当日不能进行涂片的标本，置于4℃保存，避免标本干涸或污染。
（2）抗酸染色液制备
①按标准浓度和步骤配制染色液，实验室有染色液制备配方和配制记录。
②染色液置于棕色瓶内或不透明塑料瓶内存放，避光保存；试剂瓶上标明染色液名称、浓度和制备时间。
③每次制备新的染色液后，需使用未经染色的已知阳性和阴性标本进行涂片镜检，并记录结果。
（3）涂片制备
①新载玻片需经95%乙醇脱脂。
②一张载玻片只能涂抹1份痰标本，严禁清洗后重复使用。
③避免涂抹过厚或过薄。
（4）染色
①肉眼观察染色后的痰膜应呈均匀的亮蓝色，无红色斑块。
②染色后的痰膜脱落部分应小于整个涂抹面积的10%。
（5）镜检：严禁油镜头直接接触涂片上的痰膜。
4.室间质量评估 室间质量评估是通过批量测试、盲法复检并与网络中的其他实验室比对结果，对实验室的能力进行评价的过程。
二、分枝杆菌培养检查
涂片检查可以证明抗酸杆菌存在与否，但要进一步证实细菌的死活情况、鉴定菌种及进行药物敏感性实验等，则需要进行分枝杆菌的培养。主要采用固体罗氏培养基培养，液体培养，其中快速培养仪培养法应用较多。无论采用何种方法分离培养分枝杆菌，待检标本均需要进行前处理。
（一）标本前处理
前处理的目的有两个，一是去污染（除去分枝杆菌以外的杂菌），二是液化标本。
1.痰标本前处理 目前最常用的方法是以下几种。
（1）碱处理法：是最常用的方法。在生物安全柜内将1～2ml标本转移至相应前处理管中；视标本性状，将1～2倍的4%NaOH溶液加入前处理管中，立即开始计时，涡旋振荡每30秒2～3次，室温静置，时间控制在15～20分钟。用pH 6.8的磷酸盐缓冲液3000g离心20分钟，弃上清，沉淀中加入0.5ml PBS混匀。
（2）N-乙酰半胱氨酸-2%氢氧化钠处理法：液体培养法中多采用此法。按1.0%新鲜配制N-乙酰半胱氨酸（NALC）和等体积4%NaOH液混合即得N-乙酰半胱氨酸-2%氢氧化钠混合液。按碱处理法处理痰样本。
2.其他标本前处理 脑脊液、胸腔积液腹水、支气管肺泡灌洗液等无杂菌标本可直接经3000g离心20分钟，取0.1ml接种。污染标本（如尿液、脓液、伤口分泌物等）同痰标本一样进行前处理。
（二）培养法
1.改良罗氏培养基培养法
（1）标本接种：吸取前处理后的离心沉淀物0.1ml，无菌操作接种于罗氏培养基斜面上，旋上培养管螺旋盖，避免完全拧紧，轻轻转动并放低培养管底部，保持培养基斜面水平向上，36℃±1℃孵育24小时后拧紧管盖，直立放置，继续孵育。
（2）结果判读：接种后第3天和第7天观察培养情况，此后每周观察一次，直至第八周末。发现有菌落生长，须经抗酸染色证实是分枝杆菌。
报告方式如下。
①分枝杆菌培养阴性：无菌落生长。
②分枝杆菌菌落数：菌落不足斜面面积的1/4。
③分枝杆菌培养阳性1+：菌落占斜面面积的1/4。
④分枝杆菌培养阳性2+：菌落占斜面面积的1/2。
⑤分枝杆菌培养阳性3+：菌落占斜面面积的3/4。
⑥分枝杆菌培养阳性4+：菌落布满培养基斜面。
如果发现培养基污染，报告培养污染。
2.快速培养仪检测 分枝杆菌快速培养法，主要是利用分枝杆菌快速培养仪和营养丰富的液体培养基达到快速培养的目的。目前，常用的快速培养仪主要有BACTECTM MGIT 960 培养系统。严格按仪器使用说明进行，仪器自动报告结果，需进行涂片、抗酸染色后方能判定阳性。培养至6周仍未见细菌生长，报告培养阴性。
（三）质量控制及注意事项
1.室内质量控制
（1）制定并执行标准程序操作手册。
（2）实验人员经过培训合格。
（3）人员、设备、房间固定。
（4）配制试剂记录；仪器温度记录、检测记录、维修记录等。
（5）培养基检测记录。
2.注意事项
（1）留取标本尽快处理，可短时在4℃存放，7天内接种。
（2）试剂在4℃存放，保证每次需要的试剂未接触过开放的痰标本。
（3）控制前处理时间，避免强处理或弱处理。
（4）经过20分钟仍有未液化的痰栓，应避免吸取痰栓接种培养基。
（5）液体培养基添加剂严格按要求添加。
（6）除非准备好向培养基里添加物质，否则始终要保持盖子盖牢，并尽量缩短打开试管的时间。
三、分枝杆菌菌种初步鉴定
根据分枝杆菌对某些化学试剂的耐受性不同，将菌悬液接种于含某种化学试剂的培养基上，根据细菌的生长情况可以对菌种做出初步鉴定。
（一）鉴别培养基的种类
（1）对硝基苯甲酸（PNB）鉴别培养基。
（2）噻吩-2-羧酸肼（TCH）鉴别培养。
（二）鉴别实验及结果报告
1.步骤
（1）菌株选择：临床分离株的新鲜培养物（初生长2周）或经传代培养2～3周生长良好的亚培养物。
①新鲜培养物不能存在污染菌，涂片确认抗酸杆菌。
②固体培养基上生长老化的菌落：如果可以刮取，则直接涂抹至中性改良罗氏培养基斜面上；如果菌落坚硬，则刮取至磨菌瓶，滴加少量无菌生理盐水，旋紧盖子，涡旋振荡10～20秒，制成均匀的菌液，静置5分钟，吸取0.1ml至培养基上，培养，肉眼可见菌落2～3周后进行药敏试验。
③有污染的菌落：挑取斜面上的菌落，尽量避免污染部分，将菌落放入试管中，滴加4～5滴2%氢氧化钠溶液，振荡10～20秒，静置5分钟后接种、培养。
（2）菌悬液制备：在生物柜中吸取无菌生理盐水2～3滴到磨菌瓶中，用无菌接种环多点刮取菌落，放入磨菌瓶底部，旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上振荡20秒，静置5分钟，小心打开瓶盖，加入1～2ml无菌生理盐水，静置片刻，使菌液中的大块物质沉淀，吸取上部菌液约1ml，转移至另一支无菌试管中，逐步加无菌生理盐水，直至菌液浊度与标准麦氏比浊管（MacFarland No.1）一致，即为1mg/ml的菌液。
（3）稀释与接种：取无菌培养管，标好样品编号，加入4.5ml无菌生理盐水，加0.5ml 1mg/ml的菌液，稀释成浓度为10-1mg/ml的菌液；用22 SWG标准接种环分别蘸取1环（0.01ml）10-1mg/ml的菌液，用画线法尽可能均匀分散接种到PNB和TCH培养基表面，最终接种菌量为10-3mg。同时接种改良罗氏培养基做对照。置于37℃培养。
2.结果判读 接种3～7天观察，以后每周观察一次，直至孵育4周。快速生长的非结核分枝杆菌1周左右可见菌落。缓慢生长的分枝杆菌4周后根据表4-1做判读。
表4-1 分枝杆菌培养结果
（三）质量控制及注意事项
（1）每批菌株鉴定时应有结核分枝杆菌标准株（H37Rv）和其他分枝杆菌（如堪萨斯分枝杆菌）做对照。
（2）鉴定的分离株菌龄为2～3周且生长良好。
（3）培养基、试剂必须在使用效期。
（4）所有操作必须在生物安全柜内进行。使用后柜内及实验室需要进行2小时的紫外线照射。
四、结核分枝杆菌药物敏感性实验
结核分枝杆菌耐药性检测不仅可以指导结核病开始治疗及进一步治疗时的药物选择，同时可以监测社会中耐药Mtb的流行情况。
目前耐药性实验方法有固体药敏、液体药敏和最低抑菌浓度检测。本节主要讲解普遍应用的固体药敏检测方法：绝对浓度法和比例法。
（一）绝对浓度法
绝对浓度法由Meissner于1963年提出，采用一或数个临界药物浓度作为敏感或耐药的临界浓度。我国采用罗氏培养基上的两浓度的绝对浓度法。
1.培养基 改良罗氏含药培养基。培养基有标准化的制备流程，已商品化。
2.菌悬液制备 在磨菌瓶中加入1～2滴0.5%的聚山梨酯80生理盐水，刮取的菌落量以5～10mg（半环至一环）为宜，接续方法同“菌种鉴定”。
3.菌液稀释 取无菌培养管，标好样品编号，加入4.5ml无菌生理盐水，加0.5ml 1mg/ml的菌液，稀释成浓度为10-1mg/ml的菌液，用同样的方法再进行10倍稀释，即成10-2mg/ml菌液。
4.接种及培养 用0.5ml无菌吸管吸取10-2mg/ml菌悬液，分别接种0.1ml于高浓度、低浓度含药培养基和无药对照培养基（最终接种菌量为10-3mg），37℃培养，4周后观察结果，如遇菌落微小，不利于观察时可适当延长培养时间。
5.结果报告 要求对照培养基上菌落数在200个以上，若菌落数低于50个，则要求重新进行药敏实验。对照培养基上菌落生长良好的前提下，含药培养基上生长的菌落数多于20个，可判定为耐药。结果报告方式分敏感、低浓度耐药、高浓度耐药和实报菌落数。
（二）比例法
比例法由Canetti（1963年）提出，采用了临界药物浓度和临界耐药菌比例两个切值来限定有临床意义的耐药性。在一种含药培养基上接种两种不同浓度的菌液，以含药培养基上的菌落数与不含药培养基上的菌落数之比作为药敏判定标准。
1.培养基 改良罗氏含药培养基。药物浓度不同于绝对浓度法培养基。培养基已商品化。
2.菌悬液制备 制备过程与绝对浓度法相同。
3.接种即培养 用画线法分别均匀接种0.01ml 10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液至含药培养基和无药对照培养基（最终接种菌量为10-4mg和10-6mg），培养时间和方法与绝对浓度法相同。
4.结果报告
（1）先按下列方式分别记录含药培养基和无药对照培养基上菌落数。
①少于50个菌落：报菌落个数。
②50～100个菌落：1+。
③100～200个菌落：2+。
④大部分融合（200～500个菌落）：3+。
⑤全部融合（大于500个菌落）：4+。
（2）耐药百分比的计算和解释
①计算：耐药百分比=（含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的菌落数）×100%。
②解释：若耐药百分比大于1%，则认为受试菌对此抗结核药物耐药。
（三）质量控制
（1）本操作必须在生物安全柜内按操作程序完成。
（2）严格控制培养基的质量：从颜色、质地、凝固水、匀质性、无菌性测试等方面检测。注意冷藏储存条件。
（3）含药培养基冷藏保存，应于1个月内用毕。
（4）为避免菌株由传代可能引起的变异，原则上使用原代分离培养物的新鲜菌落进行药敏实验。
（5）接种量是影响药敏实验结果的变异因素之一，操作中要尽可能保证稀释和接种量的准确和稳定，接种应由同一实验人员完成。
（6）每批测定加入一株结核分枝杆菌标准株H37Rv或H37Ra作为敏感对照，以检测含药培养基质量、稀释和接种量等因素。
（7）恒温培养箱温度的波动范围应在35～37℃。