4.2　堆肥过程腐殖质还原菌与有机质结构的响应关系

4.2.1　腐殖质还原菌与有机质氧化还原功能基团的响应关系

运用Canoco for Windows 5.0对堆肥过程中34种腐殖质还原菌与胡敏酸、富里酸中氧化还原功能基团进行典型对应分析，优选显著影响氧化还原基团的关键腐殖质还原菌。同样选取胡敏酸中氧化还原功能基团¹³C-NMR4、类酪氨酸类物质（C2）、羧基、¹³C-NMR3、SUVA₂₅₄、A_224-400及SUVA₂₉₀与富里酸结构中氧化还原功能基团多酚化合物、羧基、氨基酸、¹H-NMR1、¹H-NMR3、类富里酸物质（C1）、SUVA₂₅₄、E₄/E₆及A_224-400与腐殖质还原菌进行相关性分析。通过DCA分析表明，腐殖质还原菌第一排序轴与第二排序轴的相关系数分别为1.223和1.345，因此，选择单峰模型RDA研究堆肥过程中腐殖质还原菌与胡敏酸、富里酸中氧化还原功能基团的响应关系。

表4-3与表4-4分别为堆肥过程中腐殖质还原菌与胡敏酸、富里酸中氧化还原功能基团的RDA分析的统计信息，充分说明本研究利用RDA分析可较好地解析腐殖质还原菌与胡敏酸、富里酸中关键氧化还原基团的响应关系。

为从34种腐殖质还原菌种群中优选出一种或几种关键腐殖质还原菌，我们采用偏相关分析分别筛选显著影响氧化还原功能基团的关键腐殖质还原菌（见表4-5和表4-6）。基于偏相关分析，在34种腐殖质还原菌中，共筛选出10种显著影响腐植酸氧化还原功能基团的腐殖质还原菌；但这并不能说明其他微生物对腐植酸的氧化功能基团没有影响，微生物在整个堆肥过程中起到至关重要的作用，大部分微生物对物质转化无直接影响^［17］。堆肥过程中不同氧化功能基团的形成是多种微生物菌群的共同作用，并且不同阶段不同微生物发生的作用并不相同，在堆肥腐植酸氧化功能基团中起到间接作用^［18］。

RDA排序图可清晰解释10种腐殖质还原菌与腐植酸中氧化还原功能基团的相互关系，从图4-3（a）中，OTU5、OTU132、OTU152与¹³C-NMR3、类胡敏酸物质（C3）及SUVA₂₉₀呈正相关但与类酪氨酸类物质（C2）呈负相关。OTU5为棒状杆菌属（Corynebacterium），OTU132为Desulfobacca，OTU152为泛生菌属（Pantoea）（附表2），均常见于土壤与水体中^［19］。有研究表明Desulfobacca可作为以含乳酸盐的海水培养基为电解液的微生物燃料电池，并且对PCP还原也起到至关重要的作用^{［20，21］}；泛生菌属（Pantoea）也具有利用腐植酸作为电子穿梭体还原铁的功能^［22］。Doong^［19］研究表明，大部分微生物都具有多种代谢功能，在本研究中，此类微生物不仅对类蛋白质类物质降解起到重要作用，并且可促进酚类、醌基等物质的形成。OTU50、OTU90及OTU31与¹³C-NMR4呈显著正相关，与SUVA₂₅₄、A_224-440呈负相关。OTU50为Caldicoprobacter，隶属于厚壁菌门，主要存在于堆肥的高温期，研究表明Caldicoprobacter可在55～77℃的高温下生存，具有降解糖、半乳糖、乳糖、醛、酯及纤维素等的能力；Caldicoprobacter的呼吸过程中电子仅可传递到胞外，硝酸盐、亚硝酸盐、硫酸盐及亚硫酸盐等并不能作为它的电子受体^［23］。OTU90为短波单胞菌属（Brevundimonas），属于变形杆菌（Proteobacteria），与Caldicoprobacter类似，高温期的数量最多，可降解纤维素与木质素类物质^［24］。OTU31为芽孢杆菌属（Bacillus），是堆肥中最常见的高温菌，它不仅可以降解纤维素、木质素，对重金属还原也起到重要作用^［25］。在本研究中，此类腐殖质还原菌对堆肥胡敏酸芳香化结构形成及稳定性有直接影响。

图4-3（b）为4种腐殖质还原菌与富里酸中氧化还原功能基团的响应关系，从图中可以看出，OTU51、OTU74及OTU145与SUVA₂₅₄、A_224-440、E₄/E₆及类胡敏酸物质（C3）呈正相关，但与类富里酸物质（C1）、¹H-NMR1、氨基酸、羧基、S_R呈负相关，说明这3种腐殖质还原菌在堆肥过程中可降解氨基酸、羧基、脂肪族化合物从而促进富里酸结构的芳香化。也可以说，氨基酸、羧基、脂肪族化合物的芳香化转化过程主要依靠这3种微生物完成。其中OTU51为嗜碱菌属（Alkaliphilus），属于厚壁菌门梭菌目，属于兼性厌氧菌并存活于碱性条件下，以蛋白质为能源，此类微生物可在Fe（Ⅲ）、Co（Ⅲ）或Cr（Ⅵ）的存在下进行胞外呼吸，将其还原并维持自身生长^［26］。OTU74为粪球菌属（Coprococcus），主要存在于人或动物粪便中，可降解纤维素类物质作为自身的营养来源^［27］。OTU145为假单胞菌属（Pseudomonas），具有较强的分解蛋白的能力，但是发酵糖的能力较弱，与氨基酸呈负相关关系^［28］。OTU121为丛毛单胞菌属（Comamonas），属于β-变形菌，此类菌属发现的物种种类较少，仅有4种，分别为土生丛毛单胞菌（Comanonas terrigena）、睾丸酮丛毛单胞菌（Comanonas testosteori）、反硝化丛毛单胞菌（Comanonas denitrificans）及硝化柯玛单胞菌（Comanonas nitrativorans），这4种菌株常见于土壤、污泥及水体中，为异养型微生物，并且具有反硝化作用^［29］。从图4-3（b）可知，丛毛单胞菌属（Comamonas）与多酚、¹H-HNMR3呈负相关，说明丛毛单胞菌属可以以多酚化合物与羧基碳为营养源供自身生长，从而间接促进富里酸的电子转移能力。

4.2.2　关键腐殖质还原菌与微环境的响应关系

优选出的10种关键腐殖质还原菌与腐植酸氧化还原功能基团显著相关，可以说明这10种腐殖质还原菌对腐植酸的电子转移能力均存在显著影响，理论上，10种关键腐殖质还原菌活性的提升可增加腐植酸电子转移能力。由于腐殖质还原菌在堆肥过程中受物料微环境因子的影响^［30］，本章另一个目标是确定显著影响10种关键腐殖质还原菌的主要微环境因子，从而通过改变关键微环境因子来调控腐植酸的电子转移能力。

运用Canoco for Windows 5.0对堆肥过程中微环境因子与10种关键腐殖质还原菌进行典型对应分析，确定其显著影响关键腐殖质还原菌的微环境因子。通过DCA分析表明，第一排序轴的最大梯度为1.323，因此，选择单峰模型RDA研究堆肥过程中微环境因子对关键腐殖质还原菌的影响，分析结果见表4-7、表4-8及图4-4。

从表4-7中可以看出，RDA可较好地反映微环境与关键腐殖质还原菌的响应关系，采用偏相关分析深入研究一种或几种微环境因子的变化对腐殖质还原菌的分布产生显著影响，结果见表4-8。从微环境因子与关键腐殖质还原菌的偏相关分析可以看出，仅有有机质、N-N与关键腐殖质还原菌显著相关（P<0.05），说明有机质与N-N的变化对关键腐殖质还原菌变化起到显著作用。非度量多维尺度分析了单个微环境因子解释关键腐殖质还原菌的分布，有机质单独解释变量为32.0%（F=5.31，P=0.004）；N-N的单独解释变量为28.0%（F=5.28，P=0.008）；含水率单独解释变量为21.0%（F=2.20，P=0.082）；C/N的单独解释变量为18.0%（F=1.94，P=0.138）；温度的单独解释变量为15.2%（F=0.81，P=0.504）；发芽率的单独解释变量为14.3%（F=0.84，P=0.506）；pH值的单独解释变量为12.3%（F=0.94，P=0.442）；N-N的单独解释变量为8.4%（F=0.66，P=0.590），可溶性有机氮的单独解释变量为8.3%（F=1.72，P=0.018）；可溶性有机碳的单独解释变量为4.0%（F=0.80，P=0.518）。从以上数据可以看出，N-N、可溶性有机氮、可溶性有机碳单独解释变量最低（低于10%），这说明N-N、可溶性有机氮及可溶性有机碳单独对关键腐殖质还原菌分布影响变化最小；但由于这几种物质是微生物生长的能源与营养来源，对微生物生长及新陈代谢起到重要作用^{［31，32］}，因此，单一变量对关键腐殖质还原菌的作用并不显著，但可能与其他因子共同作用对微生物产生影响^［33］。

图4-4为微环境因子与关键腐殖质还原菌RDA排序轴，OTU5（棒状杆菌属）、OTU132（Desulfobacca）与N-N、可溶性有机碳及可溶性有机氮呈显著相关，与C/N、N-N呈负相关。从图4-4分析可以看出，OTU5、OTU132主要存在于鸡粪中，丰富的营养源可促进其生长；相关性表明，OTU5与OTU132对氮的硝化也起到重要作用，因此，可能通过堆肥过程中可溶性有机氮、可溶性有机碳或N-N含量的改变，调控这两种腐殖质还原菌属的生长。从图4-4中可以看出，OTU51（嗜碱菌属）与pH值呈正相关关系，并且主要存在于果蔬与杂草中。研究表明，嗜碱菌属主要受pH值影响，适应生存的pH值条件为7.8～10.2，而堆肥中pH值最高可达到8.89，因此，适当地调高pH值可增加此种菌属数量。但较高pH值可能会抑制OTU74（Corprococcus）与OTU145（假单胞菌属）生长，这两种腐殖质还原菌与pH值呈负相关、与C/N呈正相关。假单胞菌普遍存在于所有堆肥中，是堆肥中常见的微生物，由于堆肥过程中C/N变化范围在16.2～29.3，因此此范围内适当地增加C/N会促进假单胞菌的生长。发芽率与多种关键腐殖质还原菌呈显著相关，包括OTU90（短波单胞菌属）、OTU121（丛毛单胞菌属）、OTU31（芽孢杆菌属）、OTU50（Caldicoprobacter）和OTU152（泛生菌属）。发芽率是堆肥中的生物学指标，发芽率越高，说明堆肥毒性越低，并且还有研究表明，发芽率与堆肥过程中的醌基团呈极显著相关^［34］，那么以上几种腐殖质还原菌不仅可以促进醌的形成，而且对降低堆肥毒性也具有重要作用。此类腐殖质还原菌与有机质呈显著负相关，因此，增加这几种腐殖质还原菌的数量不仅可以促进有机质的降解，增加堆肥中醌的含量，还可以改善堆肥稳定性。

根据以上研究结果发现，堆肥腐植酸的电子转移能力与多种氧化还原功能基团紧密相关；而10种关键腐殖质还原菌对腐植酸中氧化还原功能基团的形成具有显著影响，因此，可以推测通过接种10种关键腐殖质还原菌可提高堆肥腐植酸的氧化还原能力。但由于堆肥体系较为复杂，并且对10种关键腐殖质还原菌的筛选也会面临巨大的挑战。首先要确定这几种腐殖质还原菌是否为可培养微生物，另外，筛选微生物不但要进行大量的工作，并且成功率并不理想。由于堆肥微环境是影响微生物菌群分布的关键因素^［7，35］，理论上通过优势腐殖质还原菌及其关键影响因子识别，明确微环境、腐殖质还原菌及腐植酸电子转移能力三者之间响应关系，在此基础上，可以构建一种促进腐植酸电子转移能力的微环境因子调控方法，如图4-5所示。

OTU5与OTU132主要存在于鸡粪中，受可溶性有机氮与可溶性有机碳影响显著，并对胡敏酸中的芳香碳和醌基等基团的形成具有重要作用，因此在鸡粪堆肥过程中适当添加碳源或氮源可促进胡敏酸的电子转移能力的增加。而C/N和pH值是影响OTU74、OTU145分布的重要微环境因子，这两种腐殖质还原菌与富里酸的芳香性与分子量呈正相关，因此，适当的增加C/N，降低pH值会促进这类微生物的生长，从而促进富里酸的电子转移能力增加，但这一调控方法会抑制OTU51的生长。因此，调控方法应尽可能选择使微生物之间可互惠共生的方法，OTU50、OTU90、OTU31、OTU121及OTU152主要受发芽率与有机质影响，与腐植酸中芳香碳、多酚化合物及羧基碳呈显著相关，这几种腐殖质还原菌数量增加会加速有机质的降解与堆肥的稳定性，从而改善腐植酸的电子转移能力。