3.1　堆肥过程腐殖质还原菌演替规律

对堆肥过程中腐殖质还原菌采用16S rDNA测序，结果表明21个扩增库中共检测到170个属，包含250133个高质量的腐殖质还原菌序列，其中有超过99%的序列已达到属的水平，说明腐殖质还原菌普遍存在于堆肥过程中。如图3-1所示，堆肥过程腐殖质还原菌的序列数量、多样性及丰富度均呈增加趋势，证实堆肥过程增加了腐殖质还原菌的数量与多样性。在不同堆肥物料中，污泥腐殖质还原菌数量和多样性都明显高于其他物料（P<0.05），这是由于污泥中含有大量的重金属^［2］，在堆肥过程中，腐殖质还原菌不仅能够以腐植酸作为电子受体，污泥中大量的重金属也可作为电子受体促进其生长。木质素类物料（秸秆、枯枝）中腐殖质还原菌数量最低（图3-1），这是由于腐殖质还原菌以堆肥中易降解有机质作为电子供体进行腐殖质呼吸，木质素不易被微生物降解，微生物中酶活性受到抑制，致使木质素类物料中的腐殖质呼吸相对其他物料较弱。果蔬、杂草中以纤维素为主，由于纤维素不易降解，导致其腐殖质还原菌在升温期与高温期含量较低［图3-1（a）］；然而，在高温期后，随着纤维素逐渐降解，腐殖质还原菌数量逐渐增多。而对于鸡粪与牛粪，腐殖质还原菌数量在堆肥不同阶段无显著差异，这是由于鸡粪、牛粪中存在大量易被降解的有机质，为腐殖质还原菌提供了足够的碳源，并且，由前章节结果可知，鸡粪和牛粪中的腐植酸与胡敏酸形成速率较快，因此在升温期腐殖质还原菌数量明显高于富纤维素、木质素类物料。

图3-1　不同堆肥过程中腐殖质还原菌序列数及腐殖质还原菌多样性指数

CM—鸡粪；DCM—牛粪；FVW—果蔬；WW—杂草；SW—秸秆；GW—枯枝；SS—污泥；

1—升温期；2—高温期；3—腐熟期

Beta多样性分析表明，堆肥物料种类是腐殖质还原菌群落差异的重要因素（P=0.045），而堆肥阶段对腐殖质还原菌的群落差异影响并不显著（P=0.824），表明腐殖质还原菌的群落组成差异主要归因于堆肥原料组成成分不同。PCoA（主坐标分析）结果也证实了这一结论，堆肥物料组成相似的腐殖质还原菌具有较高的相似性。不同物料中腐殖质还原菌的主坐标分析如图3-2所示。由图3-2可知，7种堆肥根据腐殖质还原菌群落结构的相似性共分为四类：第一类为蛋白类物料（鸡粪和牛粪）；第二类为纤维素类物料（果蔬和杂草）；第三类为木质素类物料（秸秆和枯枝）；第四类为污泥。这一结果与微环境因子的聚类结果较为一致，也进一步验证相似类型堆肥过程中理化性质与腐殖质还原菌的群落演替规律及多样性变化具有一致性。然而，从图中还可以发现，在不同类型物料堆肥过程中，腐熟期相对升温期与高温期的位置相距较远，说明腐殖质还原菌的群落结构组成在堆肥腐熟期发生了明显的变化，因此，堆肥过程尤其是堆肥腐熟期对腐殖质还原菌的群落组成产生影响。

图3-2　不同物料中腐殖质还原菌的主坐标分析

CM—鸡粪；DCM—牛粪；FVW—果蔬；WW—杂草；SW—秸秆；GW—枯枝；SS—污泥；

1—升温期；2—高温期；3—腐熟期

不同物料中腐殖质还原菌在属水平的群落组成如图3-3所示。由图3-3可知，7种物料不同阶段的腐殖质还原菌在门水平存在明显差异。变形菌门（Proteobacteria）是鸡粪、牛粪、秸秆、枯枝及污泥在堆肥过程中最主要的门，占总序列数的26%～99%。在果蔬和杂草中，厚壁菌门（Firmicutes）中序列数量最多，以梭菌属（Clostridia）为主，在堆肥腐熟期其百分含量由37%上升至50%，变形菌门（Proteobacteria）也是其主要分类，占总数的46%～94%。拟杆菌门（Bacteroidetes）与放线菌门（Actinobacteria）在堆肥过程中的序列总数不足20%。

在属水平，不同样品的群落组成及演替规律各不相同（图3-3）。其中，共有34个属占总序列的90%。变形杆菌中包括14个属（表3-1），较丰富的菌属有假单胞菌属、不动杆菌属、泛生菌属和假黄色单胞菌属。这几种属常见于底泥及土壤中，均属于γ-变形菌纲。如图3-3所示，假单胞菌存在于整个堆肥过程中，泛生菌属主要存在于鸡粪、牛粪、果蔬和杂草中，在秸秆、枯枝及污泥中的含量较少。上述菌属中，泛生菌、聚团泛生菌与铜绿假单胞菌属杆菌可还原腐植酸及腐植酸模板物，并维持自身的生长^［3］。α-变形菌纲中含量较高的属包括德沃斯氏菌属和短波单胞菌属^［4］。醌作为氧化还原中间体，可被鞘氨醇单胞菌还原，被还原的醌可继续将电子传递到偶氮燃料，加速其还原过程。δ-变形菌纲中主要包括Desulfobacca，在牛粪、鸡粪堆肥过程中均被检测到，该属具有还原Fe（Ⅲ）的能力^［5］。β-变形菌中数量最多的属为丛毛单胞菌属，可以腐植酸作电子受体加速对2，4-二氯苯氧基乙酸的还原^［6］。厚壁菌门主要存在于果蔬、杂草、枯枝及污泥中，以芽孢杆菌纲和梭状芽孢杆菌纲为主。芽孢杆菌纲在堆肥的高温期成为厚壁菌门的主要菌群，这主要是由于芽孢杆菌纲具有一定的耐高温的能力^［6］。拟杆菌在牛粪中百分比不足6%，其中含量最多的是鞘氨醇杆菌属，鞘氨醇杆菌属具有降解2，4-二氯苯氧基乙酸的能力^［7］。放线菌仅在鸡粪、牛粪及污泥中被检测到，含量较少，仅为7.94%～13.6%。其中包括20个菌属，棒状杆菌属、迪茨氏菌属、白色杆菌属及节细菌属为主。棒状杆菌属是鸡粪中数量最多的腐殖质还原菌，有研究报道，腐殖杆菌曾在废水中被分离，目前为止，它是棒状杆菌属中唯一被发现具有还原醌及腐植酸能力的种属^［8］。

图3-3　不同物料中腐殖质还原菌在属水平的群落组成

（其中34个属占整个序列库的90%）

CM—鸡粪；DCM—牛粪；FVW—果蔬；WW—杂草；SW—秸秆；GW—枯枝；SS—污泥；

1—升温期；2—高温期；3—腐熟期

表3-1　堆肥中占最主要含量的腐殖质还原菌的分类及百分含量