1.5　高效制备液相色谱

色谱分离技术最早出现于20世纪初，后来得到迅速发展，使得色谱分离在理论上从线性色谱发展到非线性色谱，在实践中从分析规模发展到制备规模和生产规模。近十几年来，高效制备色谱已成为当代高效分离与纯化技术的研究前沿，具有适用范围广、操作简单、产品纯度高等优点，在天然产物化学、有机合成、生化、生物工程、医药、环境分析等领域得到了广泛的应用^[6]。

1.5.1　高效制备液相色谱的原理

高效制备液相色谱的原理是利用混合物中各组分物理化学性质的差异，使它们以不同程度分布在两个不相溶的相中，且各组分可在两相的相对运动过程中，在两相中发生多次分布，从而达到分离的目的。

高效制备液相色谱并非为高效液相色谱的简单放大，其操作参数主要是通过线性放大的原理优化从分析到制备过程的操作参数。通常假设分析色谱系统和制备色谱系统的化学性质、传质过程都保持不变，分析型液相色谱的进样量、流量、收集体积等乘以线性放大系数便可得制备型液相色谱的相应参数。线性放大系数即为制备色谱柱和分析色谱柱的截面积之比与柱长之比的乘积。例如，制备液相的进样量计算公式为：

式中，Q₁、r₁、L₁分别为分析型液相色谱的进样量、色谱柱半径和柱长；Q₂、r₂、L₂分别为制备型液相色谱的进样量、色谱柱半径和柱长。

利用线性放大方法优化分析型色谱的操作参数，直接将其应用到直径更大的制备型色谱柱中，不仅可大大节约溶剂消耗，缩短整个方法开发过程的时间，且可减少样品损失，实现最有效、最快速的分离效果。

制备色谱的核心部件是色谱柱。现代高效制备液相色谱柱的特征如下^[7]：①柱长短、内径大、呈圆饼状。目前高效制备柱的柱长与常规分析柱相仿，一般为20～50cm，内径为10～1000mm，因此可以在较大的流速下不致产生很高的柱压降，从而获得高的产率。②填料颗粒小，分布窄。采用直径为10～20μm的细颗粒，孔径及粒度分布均很窄的多孔球形或非球形填料，通常每米的塔板数在20000以上，有的甚至可达到与分析柱相仿的柱效。③流速高。流动相的流速一般在5～10mL/min，以便提高产率，降低生产成本。

高效制备液相色谱按样品的进样量，可将其分为半制备或小规模制备型（≤100mg）、制备型（0.1～100g）及大规模制备型（≥100g）三种类型；而按固定相的类型，则可分为正相、反相、凝胶、离子交换、亲和色谱等不同类型。其中正相和反相色谱柱在天然产物的分离纯化中最为常用，其分离方法的比较见表1-2。

1.5.2　高效制备液相色谱溶剂系统的选择

高效制备液相色谱分离中，除了固定相对样品的分离起主要作用外，流动相的恰当选择对改善分离效果也具有重要的影响。作为流动相的溶剂应当成本低，容易购得，使用安全，纯度高，除此之外，还应满足下述要求。

① 用作流动相的溶剂应与固定相不互溶，并能保持色谱柱的稳定性。

② 溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性，并且具有低的黏度；不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。

③ 溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。对于折射率检测器，要求选择与组分折射率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。

④ 所用溶剂应具有高纯度。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～100nm。

在正相色谱中，常用流动相多是在饱和烷烃（如正己烷等）中加入一种极性较大的溶剂为极性调节剂，如异丙醚、氯仿、二氯甲烷等。通过调节极性调节剂的浓度来调节溶剂的强度，来实现所需要的分离选择性；在反相色谱中，由于固定相是非极性的，流动相的极性大于固定相，流动相的极性增加，洗脱能力降低，通常是用甲醇、乙腈或四氢呋喃等极性溶剂与底剂水组成二元或多元流动相。二元流动相一般是以洗脱力最弱的水作底剂，再加入一定量的可与水互溶的有机极性调节剂构成，常用的二元流动相组成包括甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-水。若二元流动相不能满足需要，可配置多元流动相，如在二元流动相中加入少量四氢呋喃，可改善某些难分离物质对的分离度；若色谱峰拖尾，可加入有机碱、有机酸等减尾剂，改善峰形^[8]。

1.5.3　高效制备液相色谱的工作步骤

① 样品前处理　将需要制备的样品尽可能使用流动相溶解为适合的浓度，然后用一次性滤头进行过滤，将不溶物除去，置于适合的容器中备用。

② 开机　依次打开柱温箱、高压泵、检测器、计算机电源开关、操作系统。

③ 平衡进样前的系统准备　为了平衡色谱柱并清除管路中的杂质和残留的水分，纯甲醇或乙腈冲洗流路20～30min，然后用制备样品所需要的流动相冲洗流路20min左右。

④ 制备方法的设定　a.设置程序文件，包括流动相通道、流速、检测波长、分析时间、最高压力、最低压力；b.设定分析方法的方法文件，包括文件名称、浓度单位等。

⑤ 进样及目标峰的收集　将样品进行制备并根据样品的出峰位置对目标峰进行收集。

⑥ 制备工作完成后的必要维护　冲洗流路和色谱柱：若流动相为有机相和水的混合溶剂，直接用甲醇或乙腈冲洗流路约30min，待基线无杂质峰出现后可停泵关机。若流动相中含有缓冲盐、有机酸等，则先用5%甲醇冲洗流路约60min，其次用50%甲醇溶液冲洗流路约30min，再用甲醇或乙腈冲洗流路约30min，待基线无杂质峰出现后可停泵关机。

⑦ 关机　关闭检测器的氘灯，关闭检测器、高压泵、色谱工作站、柱温箱等，最后关闭计算机电源。