第一章　脑脊液检查概述

脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）是存在于脑室和蛛网膜下腔的一种无色透明液体，对脑和脊髓具有保护、支持和营养等多种功能。正常脑脊液中无红细胞，仅有少量白细胞，其某些化学成分与血浆成分相等或稍低。许多神经系统疾病可以使脑脊液的生理、生化等特性发生改变，特别是对中枢神经系统感染，如脑膜炎和脑炎、蛛网膜下腔出血、脱髓鞘等疾病的诊断、鉴别诊断、疗效和预后判断具有重要的价值。

一、脑脊液的产生与循环

脑脊液产生的主要部位是侧脑室脉络丛，约占脑脊液的95%，其余来源于第三脑室和第四脑室等部位。脑脊液经室间孔进入第三脑室、中脑导水管、第四脑室，最后经第四脑室正中孔和两个侧孔，流到脑和脊髓表面的蛛网膜下腔和脑池。大部分脑脊液经脑穹隆面的蛛网膜颗粒吸收至上矢状窦，小部分经脊神经根间隙吸收（图1-1／见彩图1-1）。成人脑脊液总量为110~200ml，平均130ml，约占身体内体液总量的1.5%。其生成速度为0.3~0.5ml/min，每天生成400~500ml，亦即人体的脑脊液每天可更新3~4次。在某些病理情况下，脑脊液分泌明显增多，可达5000~6000ml/d。正常情况下，血液中的各种化学成分只能选择性地进入脑脊液中，这种功能称为血-脑屏障（blood-brain barrier，BBB）（图1-2）。在病理情况下，BBB破坏和其通透性增高可使脑脊液成分发生改变。通常经腰椎穿刺采取脑脊液，特殊情况下也可行小脑延髓池穿刺或侧脑室穿刺。

二、脑脊液检查的适应证

【适应证】

1.中枢神经系统炎性病变，包括各种原因引起的脑膜炎和脑炎。

2.临床怀疑蛛网膜下腔出血而头颅CT尚不能证实时或与脑膜炎等疾病鉴别有困难时。

3.脑膜癌瘤病的诊断。

4.中枢神经系统血管炎、脱髓鞘疾病及颅内转移瘤的诊断和鉴别诊断。

5.脊髓病变和多发性神经根病变的诊断及鉴别诊断。

6.怀疑颅内压异常。

三、脑脊液标本采集和处理

（一）标本采集

腰椎穿刺的操作方法：患者通常是左侧卧位，屈颈抱膝，尽量使脊柱前屈，利于拉开椎间隙。背部要与检查床垂直，脊柱与床平行。穿刺部位的确定是沿双侧髂嵴最高点做一连线，与脊柱中线相交处为第四腰椎棘突，然后选择第四、第五腰椎间隙进针，如失败可以选择第三、第四腰椎间隙或第五腰椎与骶骨间隙。常规消毒铺无菌巾后，用2%利多卡因在穿刺点局部做皮内和皮下麻醉，然后将针头刺入韧带后，回吸无血液，边退针边推注麻醉剂。麻醉生效后，操作者用左手固定穿刺部位皮肤，右手持针，针头斜面向上刺入皮下后，针头略向头部倾斜，缓慢进针。刺入韧带时可感受到一定的阻力，当阻力突然减低提示进入蛛网膜下腔，抽出枕芯脑脊液流出。脑脊液收集于无菌容器中，微生物及病毒学检测成人留取2ml，儿童留取1ml。细胞学及临床化学检测成人留取2~8ml，儿童留取1~1.5ml。第一管做细菌学检查，第二管做化学或免疫学检查，第三管做常规检查。测定压力时嘱咐患者放松，并缓慢地将双下肢伸直。

（二）标本转运

脑脊液标本必须由专人或专用的物流系统转运。为保证安全及防止标本溢出，转运过程中应采用封闭的容器。如标本溢出，则立即采用0.2%过氧乙酸溶液或75%乙醇溶液消毒被污染的环境。

（三）标本保存和接收

脑脊液标本采集后立即送检，不能及时检查的标本需保存于2~4℃环境中，常规检查不应超过4小时。脑脊液久置，细胞会破坏或变形，并可产生纤维蛋白凝集，导致细胞分布不均，使检查不准确；葡萄糖酵解可造成糖含量减低。合格的脑脊液标本基本要求：检验申请单填写清楚，注明初步诊断，专用容器标示清晰，采集量大于1ml且无外溢。

四、脑脊液实验室检查的回顾与展望

脑脊液实验室检查迄今已有一百多年的历史，最初的检查项目比较单一，仅限于包括颜色、浊度、凝固性及压力在内的理学检查。病因不同会引起脑脊液颜色及浊度发生不同的变化，这对疾病的初步判断具有积极的意义。20世纪四五十年代，伴随细胞收集器的不断探索及生物化学的蓬勃发展，脑脊液细胞计数及包括糖、氯化物及蛋白含量在内的常规生化检查逐步开展起来，使得疾病初步诊断的准确性得以提升。不同性质的中枢神经系统疾病可使脑脊液蛋白含量、葡萄糖、氯化物及细胞种类和比例发生不同程度的改变。由此可见，在神经影像学及其他脑脊液检查项目出现之前，脑脊液理学检查及常规生化检查在当时对疾病的诊断和鉴别诊断上具有举足轻重的地位。自20世纪80年代以来，随着检验新技术和新方法的发展和应用，包括脑脊液细胞学、生物化学、免疫学及分子生物学等多个学科领域的检查项目得以开展并迅速发展，广泛地应用于儿科、神经科、肿瘤科及精神科等多个临床科室，其作用也不再限于疾病的初步诊断，某些检查可直接用于疾病确诊、病情动态监测、治疗效果评价及预后评估。

（一）脑脊液形态学检查

脑脊液形态学检查主要包括两个方面：脑脊液细胞形态学检查和病原体形态学检查。

1.脑脊液细胞形态学检查

脑脊液细胞形态学检查始于20世纪初，近40年来才逐渐成为一门新兴学科——脑脊液细胞学。如何收集尽可能多地收集细胞并保持完好的细胞结构成为20世纪制约脑脊液细胞学发展的主要因素。因此，这促进了人们对脑脊液细胞收集器的不断探索。直至20世纪六七十年代脑脊液玻片离心法的发明，解决了脑脊液采集和制片的问题，堪称脑脊液细胞学史上的一大变革，大大地拓宽了脑脊液细胞学的应用范围，促进了临床脑脊液细胞学的较快发展和经验的积累。我国脑脊液细胞学的研究从开始到今天，已经经历了半个世纪的风雨历程。自20世纪60年代初期国内脑脊液细胞收集器的不断研制，以及80年代中期《临床脑脊液细胞学》和《脑脊液细胞学彩色图谱》等专著的相继出版，我国脑脊液细胞学检查得到了迅速发展。大量临床应用结果表明，脑脊液细胞学检查现已成为中枢神经系统感染性疾病、肿瘤、白血病、淋巴瘤等疾病不可替代的诊断和监测手段之一，对脑血管病、脱髓鞘疾病也有辅助诊断作用。有研究认为，脑脊液细胞学检测是明确诊断脑膜癌病的主要方法，其灵敏度约为90%、特异度达100%。近年来，随着免疫学、细胞化学、流式细胞术等新兴医学科学技术的发展，脑脊液细胞学也采用了更多的新方法和新技术。如基于免疫学单克隆抗体的脑脊液淋巴细胞亚群检测，细胞化学方法对中枢神经系统肿瘤的诊断以及电子显微镜技术对细胞内部超微结构的分析解释发病机制等均有大量的文献报道。各种技术相互结合大大地提高了检测的灵敏度和特异性。

脑脊液细胞学作为神经科学研究分支之一，无疑是近30年来细胞生物学和细胞收集、染色技术迅速发展的一种结果。随着分子生物学技术的日新月异，脑脊液细胞学正面临着巨大的机遇和挑战。今后的脑脊液细胞学研究方向要着眼于以下三个方面：①结构研究：阐明细胞、亚细胞、分子乃至量子的结构，才能阐明生命现象的本质，预见它们的功能和行为；②信息研究：生命现象的本质是信息的形成、传递与演化，细胞内存在着两个主要的信息流，即基因表达的信息流和外界信息对细胞的影响；③层次研究：生命活动是有层次的，大分子、细胞、细胞间直至人体是几个主要的不同层次结构，任何一个层次的研究都离不开整体的综合和归纳，因此要注重不同结构层次的特有生命现象的研究。

2.脑脊液病原体形态学检查

20世纪，随着各种染色技术的发展，脑脊液病原体形态学检查广泛地应用于中枢神经系统。如抗酸杆菌染色法用于检查结核杆菌，印度墨汁染色法用于检查隐球菌，免疫金胶银胶染色法用于乙型脑炎病毒的检查，镜检发现菌丝和孢子有助于真菌感染的诊断。除了朊蛋白外，其他病原体感染均伴有脑脊液细胞学改变。如寄生虫性脑炎时，脑脊液以淋巴细胞浸润为主，同时伴嗜酸性粒细胞比例增加。脑膜型脑囊虫病脑脊液嗜酸性粒细胞比例可高达80%~90%。近年来，随着脑脊液细菌培养、鉴定系统的发展以及质谱技术的应用，脑脊液中病原体检测已不仅仅依赖于过去传统的形态学观察，这也在一定程度上满足了临床对检测结果要求快速准确高效的需求。

（二）脑脊液蛋白水平检测

正常脑脊液中蛋白质含量很少，蛋白质增多主要源于血液渗透或中枢神经系统本身合成。蛋白成分的变化往往反映疾病的性质和类型。随着人们对各种中枢神经系统疾病认识的逐渐深入，其相关的蛋白改变也逐渐明朗。这对疾病的诊断、鉴别诊断具有重要价值。根据蛋白的来源、理化性质及生物学功能可将其分为酶学检测、细胞因子检测、特种蛋白检测、中枢神经系统感染相关病原体抗体检测、肿瘤标志物检测和激素检测等几大类。

1.酶学检测

正常脑脊液中含有多种酶，目前关注较多的主要有丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、磷酸肌酸激酶脑型同工酶、碱性磷酸酶等酶类，它们大多是参与能量代谢的酶，广泛地分布于人体组织中。正常情况下，血清酶不能透过血-脑屏障，因而脑脊液中的酶含量明显低于血清（CK-BB除外）。当脑组织受损伤时，脑细胞内酶的溢出或血-脑屏障通透性增加使血清中的酶向脑脊液中移行；或肿瘤细胞内酶释放均可使脑脊液中酶活性增高。因此，近年来有人采用测定脑脊液中酶活性的变化作为中枢神经系统疾病的生化指标。最初的酶学检测在中枢神经系统感染性疾病中的研究较多，不同感染性质及严重程度可引起不同程度的脑损伤及血-脑屏障通透性改变，可选择性透过分子大小不同的酶类，这在感染的诊断及鉴别诊断以及治疗效果的动态观察中具有重要的指导意义。随着神经科学的发展，脑脊液酶学检测逐渐扩展至急性颅脑损伤、脑肿瘤、神经系统退行性病变以及自身免疫性疾病等。

2.细胞因子检测

近年来，脑脊液中细胞因子检测已逐渐成为诊断中枢神经系统感染性疾病的研究热点。如白细胞介素（interleukin，IL）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、干扰素（interferon，IFN）、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）、生长因子（growth factor，GF）、趋化因子家族（chemokinefamily）等无论是在原发性感染还是开颅术后感染中都有文献报道，目前研究较多的是IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ等。有研究将中枢神经系统感染患者因病因不同划分为结核性脑膜炎组、隐球菌性脑膜炎组、病毒性脑膜脑炎组、化脓性脑膜炎组，检测发现各组别脑脊液中发生变化的细胞因子类型不尽相同，水平高低不一。研究认为脑脊液细胞因子的变化情况应用于中枢神经系统感染疾病，不仅提高了确诊率，而且为患者的尽早救治增加了机会。随着人们对细胞因子认识的深入，相关研究已经扩展到神经精神领域的多种疾病，如脑卒中、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、癫痫、精神分裂症及抑郁症等，虽然细胞因子出现了一定规律的波动，但对上述疾病的诊断、治疗缺乏特异性，仅具有参考价值。

3.特种蛋白检测

经典的脑脊液特种蛋白包括总蛋白、微白蛋白、免疫球蛋白（immune globulin，Ig）和β2微球蛋白等。总蛋白常用于鉴别细菌性与非细菌性感染，而白蛋白主要经血-脑屏障渗透而来，被认为是评价血-脑屏障完整性的理想参数。Ig变化反映了中枢神经系统体液免疫状况，除了含量外，主要参数还有IgG比率、IgG指数和IgG合成率，它们与C反应蛋白、降钙素原在中枢神经系统感染性疾病的诊断、鉴别诊断方面具有重要应用价值。神经系统变性疾病及脱髓鞘疾病为一大类常见的慢性病，随着神经科学的发展，人们对此类疾病的认识越来越深入，寻找与疾病相关的生物标志物成为临床的迫切需求。与此同时，脑脊液特种蛋白检测也从传统TP、Ig逐渐扩展到β-淀粉样蛋白、Tau蛋白、S-100 β蛋白、铁蛋白、铜蓝蛋白和一些载体蛋白（如转铁蛋白，载脂蛋白等）等多种特殊蛋白。目前，有大量文献表明，脑脊液中β-淀粉样蛋白、Tau蛋白、S-100 β蛋白以及髓鞘碱性蛋白等在AD、血管性痴呆、多发性硬化以及吉兰-巴雷综合征（GBS）等多种疾病中均有不同程度的改变，有望成为新兴的标志物。对于AD患者，脑脊液Tau蛋白的敏感度可达80% ~ 90%，特异性也较高。另有研究发现，AD相关神经丝蛋白在AD患者皮层神经元、脑组织提取物、脑脊液和尿液中均升高，且升高程度与痴呆严重程度成正相关。

另外，人们对脑脊液中载脂蛋白E（apolipoprotein E，apoE）的研究也有浓厚兴趣。脑脊液中的apoE在变性髓鞘的修复和胆固醇体内调节中起着重要作用。目前普遍认为，apoE的等位基因E4是晚发性和散发性AD的一个强风险因子。在AD患者脑内存在apoE，并且可能参与老年斑和神经纤维缠结的形成。

4.中枢神经系统感染相关病原体抗体检测

中枢神经系统感染的常见病原体包括病毒、细菌、真菌或寄生虫等其他微生物。传统的检测指标如白细胞计数，虽可为感染性质提供初步参考，但由于患者之间的差异、重复性和特异度差、标准化困难等许多因素均可影响其诊断的准确性。脑脊液蛋白含量、糖和氯的水平等标志物的诊断效能也存在一定的局限性。脑脊液培养虽然是金标准，但由于样本量少、样本污染、过程耗时及预防性应用抗生素等，培养阳性率低。病原体相关抗体检测简便快捷、特异性强，适应临床需求。目前开展的检测项目包括虫媒病毒、肠道病毒和呼吸道病毒等抗体检测以及结核杆菌抗体、脑膜炎双球菌抗体、肺炎支原体抗体、梅毒螺旋体抗体、弓形体IgM抗体和脑囊虫抗体等。有研究认为，脑脊液中病原体特异性抗体IgM阳性率低，而IgG阳性率较高，应用该检测可诊断多种病原体混合感染。

5.肿瘤标志物检测

脑脊液细胞病理学一直是诊断脑膜癌病的金标准，但肿瘤细胞在脑脊液中的出现存在相当大的随机性，且受检查者主观影响较大，容易误诊、漏诊。现已证实，脑脊液中癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、癌抗原（carcinoma antigen，CA）125、CAl9-9、CAl53等肿瘤标志物对肿瘤脑膜转移具有诊断价值。脑脊液肿瘤标志物可以作为脑膜癌病的一种早期检测手段。国内学者于2008年首次研讨制定了脑脊液中CAl25、CA153、CAl99、CA724、CYFIIA21-1、AFP、NSE、SCC和HCG正常参考值范围。近年来，较多研究表明脑脊液肿瘤标志物检测在脑膜癌、肺癌脑膜转移以及中枢神经系统生殖细胞肿瘤的诊断、鉴别诊断中具有较高的应用价值。

6.激素检测

脑脊液中激素检测根据激素来源分为下丘脑分泌激素、垂体分泌激素和腺体分泌激素。涉及下丘脑-垂体-性腺轴任何一个环节的病变，往往会引起脑脊液中相应激素水平变化。脑部其他病变也可引起激素水平改变。早在20世纪80年代，Terunori和Mitsuma等通过放射免疫法的实验表明，脑脊液中促甲状腺激素释放激素的测定可以作为某些神经性疾病活动性的一项有用指标，脊索瘤、多发性硬化急性期、脑血管病、脑萎缩、脊髓小脑变性、骨髓肿瘤、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化和GBS的脑脊液促甲状腺激素释放激素含量均有明显升高。垂体激素水平改变多数与颅脑肿瘤有密切关系。此外，缺血及出血性脑卒中患者由于应激反应以及血-脑屏障破坏或脑血管循环障碍，可导致下丘脑和垂体的损害，从而引起脑脊液一系列激素水平波动，变化幅度在一定程度上反映了病情的轻重。检测其动态变化对判断病情及评估预后有一定帮助。

综上所述，脑脊液中蛋白水平检测项目十分广泛，检测方法多为生化或免疫学分析技术。自1995年蛋白组的概念首次提出以来，脑脊液蛋白质组学近年来也取得了飞速发展。主要分析技术包括双向凝胶电泳、质谱分析和蛋白质数据库等。通过对比疾病状态下脑脊液与正常脑脊液中差异表达的蛋白，发现新的预测和诊断疾病的分子标志或药物作用的新靶点。虽然蛋白组学还是一门新兴学科，但它在中枢神经系统感染性疾病、肿瘤、神经系统变性疾病等已显示出可喜的应用前景。相信随着蛋白组学技术的不断改进，今后可利用蛋白组信息更加全面地认识许多神经系统疾病的生理、病理状态，更好地指导临床实践。

（三）脑脊液分子水平检测

得益于PCR技术和测序技术等分子生物学检测技术的快速发展，脑脊液中可检测的分子水平项目越来越多，并逐渐成为当前研究的热点。这些项目涉及疾病发生发展、诊断、鉴别诊断及治疗效果评价与预后评估等各个环节，具有不可替代的优势。

1.病原体基因检测

基因检测作为一种分子诊断手段，是通过分子生物学的方法检测脑脊液标本中是否存在病原体的核酸序列，为确定中枢神经系统感染的病原体提供了精准的结果，主要包括PCR技术和测序技术。PCR技术通过设计病毒通用性引物可以对某一类病原体进行检测，如肠道病毒、细菌、真菌、钩端螺旋体等，也可以通过特异性引物对某一种特定病原体进行鉴定。1977年，Frederick Sanger发明了双脱氧链终止法，使得基因测序成为可能，后来又出现了高通量测序。在临床表现未能提示特定病原体的情况下，测序技术使得无靶向的病原体广泛筛查成为可能。2012年，Nougairede首次通过高通量测序技术在一例脑膜炎患者的脑脊液中检测到托斯卡纳病毒，此后这方面的研究时有报道。基因检测较传统培养法灵敏度高，而特异度高于酶联免疫吸附法（ELISA）法抗体检测，几种方法联合使用在临床上更具有优势。

2.游离DNA检测

游离DNA是一种存在于血浆或血清、脑脊液及滑膜液等体液中的细胞外DNA。早在1947年Mandel和Metals发现了外周血中有游离核酸。30年后，Leon等首先报道肿瘤患者外周血中游离DNA水平高于正常人。中枢神经系统肿瘤由于血-脑屏障的作用，肿瘤相关游离DNA相比于直肠癌、乳腺癌等其他部位常见肿瘤自血液或体液的可检测性较低。即使肿瘤的侵袭性生长会破坏血-脑屏障，其DNA分子仍不能非常有效地进入外周循环，但是脑脊液在这方面具有得天独厚的优势。已有研究报道胶质瘤及中枢神经系统白血病患者脑脊液中游离DNA水平与健康对照组比较明显升高，对肿瘤的诊断有一定的价值。游离DNA的发现为疾病的非创伤性诊断、监测提供了可能，但是由于其微量存在，提取成本高，如何提取和纯化还没有一个统一标准，正常临界值尚不能确定，因此目前难以在临床广泛开展。但随着PCR技术及基因测序方法的发展，游离DNA的临床应用有着非常广阔的前景和优势，游离DNA的基础和临床研究必将成为受人瞩目的研究热点。

3.microRNA检测

中枢神经系统发生病变时，microRNA （miRNA）可从病变组织释放入脑脊液。因此，脑脊液中可存在大量脑和脊髓组织来源的miRNA，脑脊液miRNA表达谱的改变能充分反映中枢的病变情况，而且这种变化往往早于生化及影像学的改变，是理想的疾病早期诊断潜在标志物。近年来，miRNA在中枢神经系统疾病中的研究越来越得到重视。AD是一种持续性的神经功能障碍，已有研究发现AD患者脑脊液中miR-29a表达水平较对照组增高2.2倍，升高的miR-29a可诱导A β蛋白的生成，导致脑组织中A β过度沉积，形成AD的特有病理标志。鉴于miR-29a对A β蛋白生成的调节作用，推测脑脊液中miRNA检测很可能成为AD诊断的一种潜在生物标志物或治疗靶标。目前，已陆续发现多种miRNA在AD患者脑脊液中表达出现明显差异。此外，在帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、胶质瘤、癫痫、脑膜炎以及颅脑创伤等疾病中也发现了不同种类的miRNA表达谱变化。随着研究的日益深入，越来越多的疾病有关的miRNA被发现，同时这些miRNA的生物学功能及靶基因逐步得到阐释，使从基因水平对疾病的发生发展过程进行调控成为可能，为临床提供了极具价值的潜在治疗靶点。但目前有关中枢神经系统miRNA的研究才刚刚起步，后续仍需大量研究探索miRNA的变化原因和调节机制，以及它们在中枢各疾病间的作用，以期早日将miRNA应用于临床中枢神经系统疾病的特异性诊断和个体化靶向治疗。

随着科学研究的进展，人们发现单纯某一水平（蛋白质水平、转录水平、基因水平）的研究无法解释全部生物医学问题，科学家就提出从整体的角度出发去研究人类组织细胞结构、基因、蛋白及其分子间相互的作用，于是“组学”的概念应运而生。在过去的10年里，“组学”已成为科学界的流行语。包括基因、蛋白质、代谢等各种组学已经成为了迅速发展的新兴学科。与此同时脑脊液的组学研究也在如火如荼的进行中。研究表明利用各种组学技术可以发现多种神经系统疾病脑脊液中差异表达的蛋白质、核酸及其他小分子物质。这些物质的变化包括浓度或结构的修饰，都能够精确地反映中枢神经系统疾病的病理过程，所以脑脊液组学给我们提供了一个研究中枢神经系统疾病的一个独特的窗口。然而，作为一项新兴研究手段，脑脊液组学检查同时也面临着方法和应用的挑战。如组学的数据采集和分析上需要进一步提高，建立可预测性诊断系统从而达到诊断常规化又是一巨大挑战，可见未来脑脊液的实验诊断工作任重而道远。

脑脊液的实验室检查历久弥新，经过一百多年的发展，已经从单一趋向多元化，从最初的理学检查向生物化学、分子生物学迈进，从细胞、蛋白水平向基因、分子水平渗透。脑脊液的实验室检查总是伴随着人们对神经系统疾病认识的深入而不断发展，并受限或得益于当时检测技术的发展程度。在每个特定的历史时期，都有其积极的指导价值。随着神经科学的发展以及检测技术平台的日新月异，脑脊液相关检查将会成为研究者们极富兴趣的研究热点，并具有极富潜力的应用前景。我们相信会有越来越多的脑脊液生物学标志物被发掘并应用于科研和临床，并在疾病的发生机制、诊断、鉴别诊断及治疗中发挥越来越重要的指导价值。

（张丽敏）

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