第二节　效应检验技术

化学中毒时,人体细胞、器官及系统会发生相应的变化,引起一系列异常代谢反应,产生不同的效应物质。机体的这些效应物质,有的是化学中毒生物标志物,如血液锌原卟啉是职业性慢性铅中毒诊断指标之一 [1];有的反映了机体中毒严重程度,如血细胞计数反映机体贫血程度;尿微量蛋白测定了解机体肾功能损害程度;谷氨酸氨基转移酶(ALT)、胆红素、白蛋白等反映了肝脏受损情况。因此,效应检验指标虽然多数不是化学中毒诊断金标准,但其仍是化学中毒诊断、治疗及判断预后的重要依据。
效应检验结果的准确性直接影响临床医生对化学中毒诊断和确定处置方案,因此采集合格的效应检验样本、正确地运输、保存、选择恰当检验方法以及发出准确无误的检验报告,每一环节都至关重要。以上过程分为检验前、检验中和检验后三个步骤。国际标准化组织(ISO)发布的《医学实验室——质量和能力的专用要求》即ISO 15189[中国合格评定国家认可委员会(CNAS)对其进行了转化,成为《医学实验能力认可准则》CNAS-CL02] [2],对每一过程的质量控制均提出了明确要求。
本节主要从效应检验的影响因素、效应检验样本采集方法、常用效应检验技术及质量控制几方面进行阐述。
一、效应检验样本的影响因素及采集方法
不同化学中毒类型需要采集不同的效应检验样本,如铅中毒时需要采集血液标本、慢性镉中毒引起肾损伤时需要尿液标本等;而不同的检验项目对样本又有不同的要求,如检测肝功能时需要血清或血浆,检测血常规时要用EDTA抗凝血。因此采集的样本是否合适、合格对检验结果的准确性起到决定性作用,因而对检验前程序提出了严格的要求。
检验前程序指从医生开具检验单开始,包括患者准备、护士采样、样本运送、至实验室接收样本结束的过程。
国外报道,检验误差中,检验前因素占46%～68.2% [3],而国内报道来自检验前分析误差高达80% [4],而且检验前误差是仪器、试剂、质控品和标准品等所无法解决的。因此,医生开具正确的检验项目、患者准备情况、护士采集合格的检验样本、及时准确地运送等每一环节对检验结果的准确性都至关重要。
(一)影响样本检验结果的因素
样本检验结果的准确性受多种因素影响(图2-2-1),生物学变异是影响检验结果不容忽视的重要因素,检验前因素由于在检验总误差中占2/3,越来越受到重视,包括患者准备、样本采集及样本运输保存等。
图2-2-1　检验总变异的组成
1.生物学变异对检验结果的影响
因随环境、气候、时间、性别、年龄、生理周期、生活习惯等而发生的非病理性的人体内环境改变,称为生物学变异(biological variation)。
生物学变异可分为个体内变异和个体间变异两类。一个个体由于内环境不同而导致检测值波动,称为个体内变异;不同个体之间检测值的差异称为个体间变异。
1970年,Cotlove等 [5]从检测结果随机变异组成考虑,提出利用生物学变异数据计算可接受的分析变异,奠定了生物学变异作为制定质量指标的理论基础。
1999年,国际理论和应用化学联合会(IUPAC)、国际临床化学与实验室医学联合会(IFCC)和世界卫生组织(WHO)对全球检验医学分析质量指标设定策略达成共识,基于生物学变异的质量规范为广大专业人员所接受 [6],并每年进行生物学变异数据更新 [7]。
(1)地域气候:
由于海拔高度、气温等原因,人体各项生理指标有所不同。如高原地区,氧气稀薄,人群血红细胞含量和红细胞计数明显高于平原地区。
(2)种族:
人类基因图谱表明,人与人之间基因密码相似程度高达99.99%,差异仅有0.01%。正是这0.01%差异决定了人种与人种之间在外貌、身体形态和肤色、眼睛颜色、生理和生化代谢等方面的差异。如黑人红细胞比其他人种高(1～1.5)×10 12/L,血清肌酸激酶(CK)正常值比白人高,ATP肌酸磷酸转移酶水平明显比白种人或黄种人高,黑人维生素B 12水平比白人高1.35倍 [4]。
(3)昼夜变化:
不少检验指标还受昼夜交替的影响。如白细胞计数在清晨较低、下午较高。1日内最高值和最低值相差最高可达1倍。血浆促甲状腺激素在凌晨2～4时最高,晚上6～10时最低。大部分生化项目的日间变化达5%～10%,ALT在1天生理变化达5%～30%,酸性磷酸酶(ACP)日间变异高达50%～100% [8]。
(4)性别:
由于男性和女性生理结构不同,性别差异可表现在多种血液学指标上。男性比女性肌肉组织发达,所有和肌肉组织有关的指标都比女性高,如甘油三酯(TG)、CK、ALT、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌红蛋白(Mb)、ACP、碱性磷酸酶(ALP)、血红蛋白(Hb)、尿酸(UA)、红细胞计数、胆碱酯酶(ChE)、铁(Fe)、葡萄糖(GLU)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等 [9]。而女性比男性高的指标有:高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、铜(Cu)等 [8]。
(5)年龄:
随着年龄增长,机体血液某些成分也会发生变化。如新生儿白细胞较高,可达(15～30)×10 9/L,3～4天后降至10×10 9/L,约保持3个月,逐渐减至成人水平 [10]。健康儿童骨骼生长发育表现为成骨细胞分泌碱性磷酸酶增加,因此生长期儿童血清中ALP水平比健康成年人高约3倍 [9]。
(6)妊娠:
不同围生期的孕妇许多指标会发生生理性的变化。随孕期的延长,血清甲状腺激素分泌增加,肾小球滤过率增高,甲胎蛋白升高,而总蛋白和白蛋白减少 [8]。妊娠后期,胎盘产生雌激素和绒毛膜促生长激素增加,使血清GLU水平升高 [9]。
(7)饮食:
饮食习惯对血液成分的影响非常明显。一顿标准餐后,TG增加50%,AST增加20%,胆红素、无机磷(P)、钙(Ca)、钠(Na)和胆固醇(CHOL)增加 [4]。非洲人平均CHOL水平低,日本人生活方式欧美化,导致平均血CHOL水平升高,冠心病发病也有升高趋势。我国藏族居民高脂膳食的生活习惯导致其比汉族居民血CHOL水平要高 [11]。
(8)运动:
经常锻炼对血液成分也有影响,如血清LDL-C、载脂蛋白B(apo B)、三酰甘油水平降低,而载脂蛋白A(apo A)、HDL-C水平升高 [9]。
2.患者准备对检验结果的影响
(1)情绪:
原则上患者应在平静、休息状态下采集样本,特别是血液标本。患者处于激动、兴奋、恐惧状态时,可使血红蛋白、白细胞增高 [12]。
(2)运动:
运动使人体各种代谢加快,从而体液容量及分布、血液中化学成分及浓度也会相应改变。轻度运动会引起血糖升高,但剧烈运动后可能会出现低血糖和糖耐量增加 [13]。
一般来说,剧烈运动对检验结果的影响与轻度运动相似而幅度更大,有的是短暂变化:血清非酯化脂肪酸浓度先迅速下降后上升,接着丙酮酸、乳酸升高;由于呼吸急促,PCO 2下降,p H升高。有些变化持续时间较长,血清中的ALT、CK及同工酶、乳酸脱氢酶(LDH)等活性会增加 [9]。
为了减少运动对检验结果的影响,检验前2～3天内尽可能避免剧烈运动,尤其是采血前一天晚上,不能剧烈运动,注意休息。采血前不要长时间走路、跑步或爬楼梯,休息15～30分钟后再采血。
(3)体位:
由于不同体位使血液灌流量不同,因此血液成分也有变化,通常从卧位、坐位到立位,血液成分依次升高,如李素珍等对107名志愿者体位变化对生化指标影响的研究,表明血清白蛋白、总蛋白分别可升高6.48%和7.54% [14]。
(4)饮食:
饮食对检验结果的影响非常明显,如GLU在餐后1小时可升至空腹水平的1倍以上,血脂水平明显升高。因此,空腹采血可确保某些检验结果的准确,但空腹时间过长(16小时以上),可以使多项检测指标发生变化,如GLU、CHOL、TG等含量下降,而血中肌酐、UA、胆红素上升,尿酮体增加 [9]。所以检验样本采集应以空腹6～8小时为佳。
(5)饮酒:
酒中的主要成分是乙醇,饮用后很快被胃和小肠吸收,90%以上经血进入肝脏代谢,仅2%～10%通过肾脏、肺和汁液以原形排出体外 [15]。肝脏每天可代谢乙醇约50ml,饮酒后,血中乙醇水平随时间延长而降低,但其代谢产物乙醛仍维持较高水平,长期饮酒即可发展成酒精中毒 [9]。
饮酒会引起检验指标的变化。饮酒2～4小时后,血糖水平降低,乳酸及UA水平升高。持续饮酒后,乙醇直接损伤肝细胞,使血中ALT、AST活性升高,γ-谷氨酰转肽酶(GGT)升高是持续饮酒的标志 [9]。
由于乙醇及乙醛脱氢氧化,消耗大量NAD +,NADH增多,使磷酸二羟丙酮转化为α-磷酸甘油,TG合成增加;同时消耗大量胆碱,使血中乙酰胆碱酯酶降低 [15]。
(6)吸烟:
动物实验证明,吸烟可使大鼠血清CHOL、脂肪酸、磷脂、TG水平显著升高,LDL-C和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)升高,而HDL-C水平降低 [16]。
研究证明,吸烟对人血脂水平也有显著影响 [17]。与非吸烟者相比,吸烟者血清中CHOL浓度增加3.0%,TG浓度增加9.1%,VLDL-C浓度增加10.4%,LDL-C浓度增加1.7%;而血清中具有动脉保护作用的HDL-C浓度降低5.7%,载脂蛋白A-I(apo A-I)浓度降低4.2%。而且,吸烟对血脂的影响与吸烟量明显相关。另外,吸烟还会引起红细胞增多症 [18]。
(7)药物:
药物进入机体,会对检验结果产生一定影响,如糖皮质激素、雄激素刺激红细胞生成,导致红细胞计数升高;而雌激素则减少叶酸吸收而引起溶血性贫血。肾上腺糖皮质激素、利尿药、烟酸类药物等可引起血糖升高;而胰岛素,β受体阻滞剂,导致肝毒性药物如红霉素、酚妥拉明等,降糖药物磺脲类、双胍类、醛糖酶竞争抑制药、胰岛素增敏药等均可引起低血糖 [9]。
(8)脂血:
随着生活水平提高,蛋白质和脂肪过量摄入,血液中可出现乳糜微粒,浊度增加,会对部分检验结果产生影响,如血常规中血红蛋白升高,MCH、MCHC明显升高 [19]。生化指标中胆红素受脂血影响最大,轻度脂血也可引起胆红素升高;严重脂血时,ALT、AST和尿素(UREA)在全自动生化分析仪(湿化学法)上无法检测出,电极法检测K +、Na +、Cl -亦失败,总蛋白和肌酐明显偏低 [20]。
3.体外因素对检验结果的影响
(1)溶血:
由于采血不规范、抗凝剂与血液比例不适当、采血管不合格或血样放置时间过长,会导致标本溶血。红细胞溶解后,其内容物释放入血浆,由于某些成分,红细胞内和血浆中差异很大,所以溶血会使血浆或血清中的一些成分浓度升高,如钾、乳酸脱氢酶、天门冬氨酸氨基转移酶等;而红细胞内含量低的成分,溶血后会稀释血清,导致检测结果降低,如钙、钠等 [12]。
(2)黄疸:
胆红素对检测结果产生黄色反应的会产生正干扰,如使TG升高 [21];但会造成血磷偏低 [22]。
(二)效应检验样本的采集方法
不同的检验项目,采集不同的检验样本,所用的采集方法亦不相同。血液、尿液、粪便等标本采集,国家均有相应的标准指南。
1.血液标本采集
原则上患者应在平静、休息状态下采集血液标本。医护人员要根据不同的需求选择不同的采血管,并严格按照标准操作规程采集血液标本。具体操作方法参照中华人民共和国卫生部卫生行业标准《真空采血管及其添加剂》和《临床化学检验血液标本的收集与处理》 [23,24]。
2.尿液标本采集
随机尿、晨尿和计时尿标本等由患者自行留取,医护人员应指导患者留取。无论患者自行留取还是需医护人员留取的尿标本都要严格按操作规程留取,具体操作方法参照中华人民共和国卫生部卫生行业标准《尿液标本的收集与处理指南》 [25]。
3.粪便标本采集
粪便标本采集方法因检查目的不同而有差别,一般检验留取手指头大小(约5g)新鲜粪便即可。隐血试验,应嘱患者禁食动物性食物,连续检查3天,并选取外表及内层粪便,尽快送检。具体操作方法参照中华人民共和国卫生和计划生育委员会医政医管局《全国临床检验操作规程》 [26]。
4.骨髓标本采集
具体操作方法参照中华人民共和国卫生和计划生育委员会医政医管局《全国临床检验操作规程》 [26]。
5.其他体液标本采集
如脑脊液、精液、阴道分泌物、痰液等标本采集方法参照中华人民共和国卫生和计划生育委员会医政医管局《全国临床检验操作规程》 [26]。
二、效应检验技术
化学中毒常用效应检验技术及方法包括:血液学检验,尿液、粪便等体液检验,生化检验,免疫学检验等。《职业健康监护技术规范》(GBZ 188-2014)也对接触57种化学危害因素的职业人群体检提出63项效应检验要求,如血常规、尿常规、肝功能检查、肾功能检查等。现分别介绍如下:
(一)血常规及网织红细胞计数
一般血常规检查是指对血液中各种有形成分进行计数、分类的检查,包括红细胞计数、白细胞计数及分类、血小板计数和血红蛋白定量等,目前高端血液分析仪也可计数网织红细胞。血常规检查是临床上最古老也是最常用的检验指标之一,但也是最容易引起争议的检验项目。
自从1673年在显微镜下观察到红细胞,Neubauer在1855年发明了细胞计数板,人们开始了对血细胞计数。1953年,Coulter兄弟利用电阻原理发明了世界上第一台血细胞计数仪。随着技术的不断进步,对白细胞进行分类,血细胞计数仪已逐渐发展成三分群血液分析仪、五分类血液分析仪,目前技术参数达70项之多,甚至包括对网织红细胞和幼稚细胞的计数。如今各医疗单位多已使用五分类血液分析仪进行血常规检查,下面以五分类血液分析仪为主介绍血常规检查的方法。
1.原理
不同厂家的产品,其原理各不相同,因此各有优缺点(表2-2-1),可根据检测目的不同选择不同类型的仪器。
表2-2-1　各种血液分析仪检测原理及特点
2.仪器与试剂
一次性真空采血针,EDTA·K 2抗凝采血管,血液分析仪及配套试剂,碘伏,无菌棉签等。
3.方法
(1)采血:
患者按要求准备,采集肘前静脉血,注入EDTA·K 2抗凝采血管,轻晃摇匀;
(2)检测:
严格按仪器操作规程操作,上机检测。通常在采血后30分钟至4小时内检测。
4.参考范围
参照中华人民共和国卫生行业标准《血细胞分析参考区间》(WS/T 405) [27](表2-2-2)。
表2-2-2　中国成年人群血细胞分析参考区间
续表
注:此参考区间适用于静脉血的仪器检测方法
网织红细胞计数及百分比的参考区间,目前还没有卫生行业标准,手工法多采用《全国临床检验操作规程》(第4版)推荐的参考区间。仪器法因受检测方法、试剂及人群的影响,建议各实验室应根据仪器、试剂说明书和当地人群情况,制订自己的参考区间。
网织红细胞计数(手工法):(24～84)×10 9/L
网织红细胞百分比(手工法):0.5%～1.5% [26]
5.临床意义
血常规检查是临床最常用检验项目之一,是贫血、白血病初步筛查指标之一,也是炎症、过敏的判断指标。化学中毒时,血常规项目也会出现不同程度异常。不同化学物中毒,或同一化学物中毒随中毒程度不同或病程不同,其血常规检查结果也可各异。
(二)血细胞形态学检查
血细胞形态学检查是一种古老的血液检查方法,虽然血液分析仪已普及,但外周血涂片检查仍是血常规检查的金标准 [26]。
1.原理
目前常用瑞氏(Wright)或姬姆萨(Giemsa)染色法。该方法使细胞着色既有化学亲和反应,又有物理吸附作用。各种细胞由于其所含化学成分不同,对染料的亲合力也各不相同,因此,染色后各种细胞及其细胞成分呈现不同的染色特点。
2.试剂及耗材
瑞氏或姬姆萨染液,缓冲液,载玻片,推片等。
3.操作步骤
(1)血涂片制备:
手工推片法。在载玻片近一端1/3处,加一滴混匀的血液,推片以30°～45°角使血滴沿推片迅速散开,快速、平稳地推动推片至载玻片另一端,使血涂片呈舌状或楔形,干燥后染色。亦可用推片机推片。
注意血涂片应呈舌状,头、体、尾三部分分明,涂片面积大小以覆盖玻片近2/3,薄厚以略能透过字迹为宜,尽快干燥,防止细胞变形缩小。
(2)染色:
血涂片加瑞氏或姬姆萨染液数滴,以覆盖整个血膜为宜,再加等量缓冲液,室温染色5～10分钟。流水冲去染液,干后镜检。
4.检查内容
对外周血中红细胞、白细胞、血小板大小、形态、染色及结构进行检查,并对数量进行评估。
(1)红细胞形态学检查:
有助于各种贫血、红细胞增多症和红细胞形态异常性疾病诊断和鉴别诊断。
1)大小异常:
常见小红细胞、大红细胞、巨红细胞、红细胞大小不等。
2)形态异常:
主要有球形红细胞、靶形红细胞、缗钱状红细胞、泪滴形红细胞、椭圆形红细胞、棘形红细胞、口形红细胞、镰形红细胞、红细胞碎片、红细胞聚集等。
3)染色异常:
浅染红细胞、浓染红细胞、嗜多色性红细胞、嗜碱性红细胞、点彩红细胞。
4)结构异常:
卡波环(Cabot ring)、豪焦小体(Howell-Jolly body)、有核红细胞、红细胞内其他异常结构。
5)原始及幼稚红细胞:
报告类型及数量。
(2)白细胞形态学检查:
主要是对中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞5种白细胞形态进行检查及数量评估,有助于白血病诊断、鉴别诊断及疗效监测,了解感染的程度,提示血液相关性疾病等。
1)中性粒细胞:
包括中性杆状粒细胞、中性分叶核粒细胞的比例,核象变化,中毒性变化如中毒颗粒、空泡、Döhle小体、核变性等,中性粒细胞畸形等。
2)淋巴细胞:
观察成熟淋巴细胞形态,注意异型淋巴细胞,淋巴卫星现象是受到大剂量射线后或其他理化因素、抗癌药物等造成的细胞染色体损伤,是致畸、致突变指标之一。
3)嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞:
观察基本同中性粒细胞,不再赘述。
4)原始及幼稚白细胞:
报告类型及数量。
5.临床意义
仪器法检查血常规,准确地描述了血细胞数量、体积及血液中的含量,但对血细胞形态结构无法判断,血涂片检查则形象地反映了血细胞数量、形态、染色、结构特征等。因此,血细胞形态学检查是血常规复检的主要内容。
化学中毒时,血涂片检查则能客观地观察到异常血细胞形态及特有的中毒颗粒,如三氯乙烯等多种化学物质中毒时白细胞中均可出现中毒颗粒;苯胺中毒时红细胞中出现赫恩滋小体等,这是仪器法检查血常规所无法做到的。
(三)骨髓细胞学检查
骨髓是成人造血器官,骨髓细胞学检查是以形态学检查为代表,评估骨髓造血功能的方法,主要有骨髓细胞形态学检查、细胞遗传学及细胞分子生物学等技术 [26]。
1.骨髓细胞形态学检查
以骨髓涂片为标本,进行传统细胞学检查的血液学诊断方法,主要观察骨髓细胞形态、数量等变化,借以了解骨髓造血功能状况。
(1)原理:
采用瑞氏或姬姆萨染色法,原理同血细胞形态学检查。
(2)试剂与耗材:
同血细胞形态学检查。
(3)操作步骤:
1)骨髓取材:
成人首取髂后上棘,其次为髂前上棘。胸骨也是采集部位之一。3岁以下小儿可穿刺胫骨。
2)骨髓液采集:
吸取骨髓液量不宜过多,一般以0.2ml为宜,不需抗凝,迅速置于载玻片上。必要时可用EDTA·K 2抗凝。
3)推片:
取未抗凝骨髓液迅速推片6～8张,迅速挥干。
4)染色:
同外周血涂片检查。
(4)检查方法及内容:
先用低倍镜观察,确认有无微小骨髓小粒和油滴、染色满意性,有核细胞多少、有无明显骨髓稀释、有无异常细胞等。然后用油镜进一步确定细胞类型和分类。
1)骨髓小粒和油滴检查:
油滴为发亮的大小不一的空泡结构,正常骨髓涂片油滴为“+～++”,造血功能减退时油滴增加,白血病等有核细胞增多时则减少。骨髓小粒为鱼肉样至油脂样,大小不一,骨髓小粒明显存在是穿刺成功的标记,正常骨髓小粒为“+”,造血旺盛时增多。
2)有核细胞数量检查:
检查骨髓涂片有核细胞数量有无明显变化,我国多采用五级分类法:增生极度活跃,增生明显活跃,增生活跃,增生减低,增生重度减低。正常骨髓为增生活跃,不同血液病时增生表现不同。
3)巨核细胞检查:
对巨核细胞进行数量、分类、形态检查,了解骨髓血小板生成情况。
4)细胞分类计数和粒红比值计算:
骨髓细胞分类分为有核红细胞(ANC)、非红系细胞(NEC)分类和单系细胞分类等。ANC分类后,以百分数为基数,计算总的粒系细胞和有核红细胞,求出粒红比值。
5)细胞形态检查:
包括细胞形态变化,如高尔基体发育、细胞毒性变化、大小变化和病态造血性异常等,还有异常增多的幼稚细胞和异常出现的细胞等。
6)细胞化学染色检查:
以细胞形态学为基础,运用化学反应原理对血细胞内蛋白质、核酸、酶类、糖类、脂类及无机盐类进行定性、定位、半定量分析的方法。常用方法有过氧化物酶染色、酯酶染色、磷酸酶染色、糖类染色、脂类染色和铁染色。具体方法见中华人民共和国卫生和计划生育委员会医政医管局《全国临床检验操作规程》,不再一一赘述。主要用于辅助诊断急性白血病类型;协助血液系统疾病诊断和鉴别诊断;观察疾病疗效和预后;探讨发病机制等。
2.细胞遗传学检查
通过采集骨髓、血液、体液或其他穿刺液标本,制备染色体并对染色体显带后,进行染色体核型分析,确定染色体数目和结构等有无异常。
染色体制备常用直接法、短期培养法和同步法。直接法操作简单,但分裂象数量较少,染色体质量较差,异常核型不易检出。短期培养法可改善上述缺陷,是普遍采用的方法。同步法可获得长度适宜、形态良好及显带清晰的染色体,但操作要求高,分裂指数低。下面以短期培养法介绍染色体检查方法。
(1)原理:
培养24小时或48小时,使细胞处于分裂中期,应用秋水仙素中止分裂,使染色体收缩,形态典型并易于观察和分析,再通过染色识别染色体形态及条带。
(2)试剂:
1640培养液、磷酸缓冲液、0.2%肝素、秋水仙素(碱)溶液、0.075mol/L氯化钾溶液、3∶1甲醇冰醋酸溶液、10%Giemsa染液、喹吖因荧光染液等。
(3)操作步骤:
1)细胞接种培养:
用肝素润湿的针筒抽取一定量骨髓液,立即注入含1640培养液的培养瓶中,将培养瓶37℃培养24小时或48小时。
2)中止细胞分裂:
向培养瓶中加入秋水仙素(碱)溶液(使终浓度为0.05μg/ml)处理1小时,离心,弃去上清液。
3)低渗处理:
用37℃预温的0.075mol/L氯化钾溶液处理细胞,离心,弃去上清液。
4)固定:
加入3∶1甲醇冰醋酸溶液,反复多次固定,制作细胞悬液。
5)制片:
吸管将细胞悬液吹打混匀后滴片,火焰干燥。
6)染色:
根据情况选择不同染色方法。
(4)检查内容:
1)染色体显带:
用荧光染料染色或染色体经特殊处理后以吉姆萨染料染色,可使染色体不同区段显示明暗条纹。
2)染色体核型分析:
根据染色体长度、着丝点位置、臂比、有无随体等,并借助染色体分带技术对染色体进行分析、比较,确定有无染色体数目及结构异常,通常要求分析20～25个中期分裂象。
3.细胞分子生物学检查
即基因诊断,通过基因检测技术发现染色体畸变所累及的基因及其表达产物,检出基因水平的异常。对于造血和淋巴组织肿瘤,尤其是白血病诊断分型、评估预后和指导治疗都非常重要。
4.临床意义
骨髓细胞学检查是确诊造血系统疾病、某些类脂质沉积病、感染性疾病、恶性肿瘤骨髓转移等的手段,并可协助诊断或鉴别诊断某些血液病及其相关疾病,评估血液病的预后,指导治疗用药。化学中毒时,骨髓细胞学检查是诊断或鉴别诊断血液损害性疾病的重要手段,如苯中毒性白血病多引起慢性粒细胞性白血病,只有骨髓细胞学检查可以鉴别慢性粒细胞性白血病和急性粒细胞性白血病。
(四)尿液常规检验
尿液是机体排泄废物的主要方式,化学中毒时,尿液中可能出现异常排泄物,这是中毒导致肾脏损伤的判断指标之一;《职业健康监护技术规范》(GBZ 188-2014)涉及的57种化学危害因素接触者均要求进行尿液常规检查。
尿液检验除尿量、颜色、透明度等,其他化学检查可通过尿液分析仪进行,尿沉渣主要进行形态学检查,尿妊娠试验则采用免疫法 [26]。
1.尿液常规检查 [28]
(1)原理:
利用光电比色原理,根据试纸条上试剂区与尿液中生化成分反应产生的颜色变化,测定尿液中生化成分含量。仪器用单色光对试纸条上试剂区进行逐项扫描,将扫描得到的光信号转换成电信号,由电信号的强弱计算出试剂区反射率。仪器根据反射率确定尿液中生化成分含量。
(2)仪器与试剂:
尿液分析仪及配套试纸。
(3)尿液标本收集与保存:
1)尿液标本收集:
收集尿液最好使用一次性清洁有盖容器,由透明且不与尿液发生反应的材料制成。不同检验目的,收集的尿液也不相同。常用尿液标本有以下几种:①晨尿:清晨起床后,未进食或运动前的尿液,称为晨尿,一般留取中段清洁尿。此时尿液较浓缩,条件恒定,是较理想的检验标本。②随机尿:随时排泄,无需患者任何准备的尿液称为随机尿,适用于常规及急诊检查。③导管导尿、耻骨上穿刺留取尿液标本:无法自行留取尿液者,在医护人员协助下完成。
所有尿液标本应避免被生殖道分泌物、阴毛、微尘、油污、洗液等污染。
2)尿液标本防腐与保存:
尿液常规检查通常不使用防腐剂,应在2小时内进行尿液分析。
(4)尿液常规检查操作步骤:
以半自动尿液分析仪为例介绍。
1)尿液分析仪开机,仪器自检通过后进入主屏幕,此时工作台检条区有红色光交替闪烁。
2)将试纸条的试剂区完全浸入新鲜的、充分混合的、未离心的标本后取出,将试纸条侧边沿尿样容器壁刮去多余尿液。
3)将蘸有尿液的试纸平放在工作台检条区,确保试纸同工作台前壁接触。
4)仪器检测到试纸存在后,推进器将试纸推到测试区进行测试。
5)推进器退回原位,放下一条试纸……,这样实现连续测试。
6)测试结束后,输出测试结果。
(5)尿液常规参考区间:参照中华人民共和国卫生和计划生育委员会医政医管局《全国临床检验操作规程》(第4版) [26],见表2-2-3。
表2-2-3　尿液常规参考区间
在尿试条结果同时满足下列条件时,可不进行尿沉渣检查:①白细胞结果为阴性;②亚硝酸盐结果为阴性;③尿蛋白结果为阴性;④红细胞结果为阴性。否则,必须进行镜检复核。
2.尿液有形成分检查
尿液常规化学检查仅是一个过筛试验,尿液中的有形成分如细胞类、管形类、结晶类或其他有形成分细胞、黏液丝等必须通过形态学检查确定,这是诊断和鉴别诊断泌尿系统疾病的重要依据。实验室通常采用尿沉渣显微镜检查法或尿液有形成分分析仪进行检验。
(1)尿沉渣显微镜检查法:
1)原理:
通过离心,使尿液中的有形成分浓缩,进行显微镜观察。
2)仪器与耗材:
低速离心机,15ml刻度离心管,光学显微镜,载玻片,盖玻片等。
3)操作步骤:
①取刻度离心管,倒入混合后的新鲜尿液10ml,相对离心力400g/min离心5分钟;②弃上清,留下约0.2ml,混匀;③取尿沉渣滴在载玻片上,用18mm×18mm盖玻片覆盖后镜检。
4)结果观察:
低倍(10×10)全片至少20个视野,求出一个视野管型平均值,高倍(40×10)至少10个视野各种细胞的最少至最多。尿结晶以每一高倍视野“-、±、1+、2+、3+”等级报告(表2-2-4)。
表2-2-4　尿结晶、细菌、真菌、寄生虫等报告方式
摘自《全国临床检验操作规程》(第4版)
5)参考区间:
因各实验室所取尿量、离心力、沉渣量、计数板规格等不尽相同,尿沉渣显微镜检查参考区间应由各实验室自己通过必要的验证或评估来确定。国内外文献报道略有差异,国内《实用内科学》所提供参考区间与《希氏内科学》相同(表2-2-5)。
表2-2-5　《实用内科学》尿沉渣检查参考区间
3.临床意义
尿液是机体排泄多余水分、体内代谢废物的主要途径之一,化学中毒导致泌尿系统出现病变时,尿液成分也会出现不同程度改变,因此,尿液检查可作为某些化学中毒效应检查指标,如酚类中毒时,尿呈棕褐色、咖啡色、绿色,与空气接触即刻变成黑褐色,临床上称为“酚尿”,这是酚中毒的特征性病变。
(五)粪便常规检验
粪便是机体排泄代谢废物的另一主要途径,粪便异常时往往提示消化系统疾病。粪便常规检验包括一般性状检查、显微镜检查及隐血试验 [26]。
1.粪便标本采集原则
(1)收集粪便标本方法因检查目的不同而有差别,常规检查留取指头大小(约5g)新鲜粪便,放入干燥、清洁、无吸水性一次性有盖容器内送检即可。
(2)常规检验不能采取尿壶或便盆中的粪便标本,也不可混入尿液、植物、泥土、污水等。
(3)粪便标本应选择其中脓血黏液等病理成分检查,若无病理成分,可多部位取材。采集标本后,应在1小时内完成检查,否则可因p H及消化本身等影响而使粪便中细胞成分破坏分解。
(4)隐血试验 应嘱患者于收集标本前3天起禁食动物性食物。连续检查3天,并选取外表及内层粪便。收集标本后须迅速检查,以免因放置时间长使隐血反应敏感性降低。
2.检查方法
(1)一般性状检查:
主要是肉眼观察粪便标本的颜色、性状及较大寄生虫虫体(表2-2-6)。
表2-2-6　粪便标本一般性状检查与临床意义
(2)粪便显微镜检查:
分为直接涂片镜检和特殊的寄生虫镜检法,通常粪便常规检查采用直接涂片镜检法即可。
1)操作步骤:
洁净玻片滴加生理盐水1～2滴,选取粪便有特征病变部分或挑取不同部位粪便直接涂片,厚度以能透过书上字迹为宜,并覆以盖玻片。
2)临床意义:
正常粪便不出现或极少出现白细胞、红细胞及其他细胞,若出现,则提示有病变(表2-2-7)。化学中毒时,如急性砷中毒、误服汽油等可引起呕吐、腹泻等消化系统症状,通常不导致粪便性状或细胞形态异常,但可鉴别腹泻的原因。因此,粪便常规检查是化学中毒时鉴别消化系统病变的常规检查方法之一。
表2-2-7　粪便显微镜检查临床意义
(3)粪便隐血试验:
上消化道少量出血时,红细胞被消化而分解破坏,由于显微镜下不能发现,称为隐血。目前,粪便隐血试验常用化学法或免疫法测定。
1)化学法:
①原理:血红蛋白中的亚铁血红素有类似过氧化物酶的活性,能催化H 2O 2作为电子受体使色原(如邻联甲苯胺)氧化而显色(如邻联甲苯胺氧化成邻甲偶氮苯显蓝色);②试剂:10g/L邻联甲苯胺冰醋酸溶液;3%过氧化氢液;③操作步骤:挑取少量粪便涂在专用的白纸板上,滴加10g/L邻联甲苯胺冰醋酸溶液2～3滴,再加3%过氧化氢液2～3滴,立即观察结果,2分钟内显蓝色为阳性。
2)免疫法:
①原理:采用抗人血红蛋白抗体与粪便中人血红蛋白特异性结合以检测粪便中有无血液。目前免疫法有胶乳凝集法、EIA法、胶体金法和免疫层析法等。本试验不受动物血红蛋白干扰,试验前不需禁食肉类。②操作步骤:根据不同试剂盒说明书操作。
3)两种方法的优缺点:
化学法操作简便,成本低,敏感性强,但试剂易失效,而且无法区分人和动物血液,故试验前应禁食肉类。免疫法灵敏度高,特异性强,但出血在粪便中分布不均匀或粪便处理不当都可能导致阴性结果,而某些刺激胃肠道药物可能使正常人出现阳性结果。
4)临床意义:
消化道出血时本试验阳性。消化道恶性肿瘤时,粪便隐血可持续阳性;而溃疡时呈间断性阳性。抗凝血类杀鼠剂灭鼠灵中毒可导致消化道出血,粪便中可见红细胞或隐血阳性。另外,《职业健康监护技术规范》(GBZ 188-2014)中砷化氢和二甲基甲酰胺急性中毒应急检查时均要求检查粪便隐血试验。
(六)生化分析技术
生物化学,是研究生物细胞内各组分,如蛋白质、糖类、脂类、核酸等生物大分子的结构和功能进程的生物学分支,简称生化。生化分析技术是通过化学方法研究机体成分的分析技术,是疾病诊断的重要依据。
1886年,Jaffe发明碱性苦味酸法测定肌酐的方法,开创了生化分析技术的历史。20世纪初之前,分析多采用重量分析法和容量分析法(滴定法),均为手工操作,灵敏度低、耗时长、可重复性差,限制了生化分析的发展。1904年,Folin用比色法测定肌酐,比色法和光度法的应用,使生化分析技术发生了根本性改观。20世纪60年代后,超微量分析、免疫学、放射性核素等技术的应用,使生化分析日益扩大深入;自动化装置和电子计算机数据处理系统的使用,使大量、精确处理生化标本成为可能。
目前,全自动生化分析仪(chemistry Analyzer)是临床检验中最常用的主要分析仪器之一,它通过对血液或其他体液的分析来测定各种生化指标,如酶类、蛋白类、脂类、葡萄糖、电解质或其他机体代谢成分等,是疾病诊断的重要依据,也是化学中毒的主要效应指标。《职业健康监护技术规范》(GBZ 188-2014)涉及的57种化学危害因素接触者均要进行相应的生化项目检验。
1.原理
生化分析仪属于光学式分析仪器,它主要是基于物质对光的选择性吸收,即分光光度法,利用光电比色原理来测量体液中某种特定化学成分。生化分析仪单色器将光源发出的复色光分成单色光,特定波长的单色光通过盛有样品溶液的比色池,光电转换器将透射光转换为电信号后送入信号处理系统进行分析。常用主要生化项目的检测原理见表2-2-8。
表2-2-8　常用主要生化项目的检测原理
续表
2.仪器与试剂
生化分析仪及配套试剂。
3.操作步骤
不同的生化仪操作步骤各不相同,应严格操作说明书操作。
开机→试剂装载项目→定标→运行→质控品标本测定
4.参考区间
化学中毒常用生化检验项目参考区间见表2-2-9。
表2-2-9　常用生化项目的参考区间
续表
续表
注:以上参考区间均来自中华人民共和国卫生部《临床常用生化检验项目参考区间》(WS/T 404.1～3-2012,WS/T 404.5～8-2015)和中华人民共和国卫生和计划生育委员会医政医管局《全国临床检验操作规程》(第4版)。
*:试剂中含5’-磷酸吡哆醛
5.临床意义
生化分析是检测存在于血液或其他体液中的各种离子、糖类、脂类、蛋白质以及各种酶、激素和机体的多种代谢产物的含量,为临床医生提供诊断与治疗依据,并能帮助临床确定病情、监测治疗效果。化学中毒时,机体可能出现各个方面的损伤,可以通过生化指标表现出来。如三氯乙烯药疹样皮炎表现为严重肝损害,患者血清ALT明显升高,甚至高达6000U/L左右 [29]。慢性镉中毒时,肾小管吸收功能受损,尿液中小分子蛋白质增多,β 2-微球蛋白是慢性镉中毒诊断指标之一。
(七)凝血常规检查
凝血功能障碍是一种临床症状,而不是一种疾病。如遗传性血友病,因先天性缺乏凝血因子Ⅷ或Ⅸ导致凝血功能障碍,血小板数量及形态、凝血酶原时间、凝血酶时间正常,但部分凝血活酶时间延长。而化学中毒时,直接引起血凝血功能障碍的并不多,多为并发症状,如三氯乙烯中毒引起严重肝损害,纤维蛋白原合成减少,从而引起凝血时间延长。
凝血常规检查是临床常用的筛查凝血功能异常的试验,包括活化部分凝血活酶时间(activalted partial thromboplastin time,APTT)、血浆凝血酶原时间(prethrombin time,PT)、凝血酶时间(thrombin,TT)和血浆纤维蛋白原含量(fibrinogen,Fg),手工法测定也可,目前多用全自动血凝仪和半自动血凝仪进行测定。
1.原理
不同的凝血仪其检测原理并不相同,主要有磁珠法和光学法。
磁珠法是在反应杯中加入磁珠,在驱动装置作用下,磁珠在反应杯底部做匀速往复运动。当反应杯中加入血清和试剂后,混合液体会随着反应时间越来越黏稠,而磁珠运动则会随着混合液体黏度增大,其速度和振幅越来越小,最终停止下来。将磁珠由运动到停止这段时间定为测量到的凝固时间。该方法可以避免光学法不能完全避免的溶血、黄疸、脂血等标本问题。
光学法是将试剂和血浆混合后,纤维蛋白原转变为纤维蛋白而凝固,血浆混浊度随之增加,仪器通过测量散射光强度的改变来测定计算凝血时间。标本有溶血、黄疸或脂血时,结果会受影响,甚至检测不出。
2.仪器与试剂
血凝仪及配套试剂。
3.标本采集
清晨空腹采血最佳,尤其采用光学原理的凝血仪时。1∶9枸橼酸钠(枸橼酸钠浓度0.129mol/L)抗凝静脉血2ml,3000rpm/min离心10分钟,取血浆在4小时内检测。
4.操作步骤
仪器开机,放置试剂及反应杯,检测正常后,取血浆放在凝血仪标本架上,按操作说明进行检测。
5.参考区间
参照中华人民共和国卫生和计划生育委员会医政医管局《全国临床检验操作规程》第4版(表2-2-10)。
表2-2-10　凝血常规参考区间
6.临床意义
凝血常规是筛查凝血障碍的一个指标,化学中毒时,若出现严重肝损害、肾损害、并发弥散性血管内凝血时,应注意监测凝血常规。《职业健康检查技术规范》 [30]中要求,二甲基甲酰胺中毒应急检查需检测血浆凝血酶原时间。
(八)血气及酸碱分析
血气分析是医学上常用于判断机体是否存在酸碱平衡失调以及缺氧和缺氧程度等的检验手段 [26]。任何引起机体通气障碍或缺氧的疾病均可导致血气分析异常。化学中毒如甲醇中毒、急性氯气中毒时,可出现酸碱失衡,因此,血气分析是部分急性化学中毒时的重要效应检验指标和疗效监测指标。
1.原理
多用血气分析仪由专门的气敏电极分别测出O 2、CO 2分压和p H三个数据,并推算出一系列参数。
2.仪器与试剂
血气分析仪及配套试剂。
3.标本采集
标本为动脉血,常以桡动脉、肱动脉、股动脉为主。采用抗凝针筒,穿刺动脉取血2ml,不能有气泡,抽出后立即用小橡皮封针头,立即送检。
4.操作步骤
按仪器操作说明书操作。
5.参考区间
参照中华人民共和国卫生和计划生育委员会医政医管局《全国临床检验操作规程》 [26](表2-2-11)。
表2-2-11　血气分析参考区间
6.临床意义
机体内产生或摄入的酸性或碱性物质超过了机体代谢能力,这些物质就会在体内过度蓄积,从而引起酸碱失衡。多种化学中毒均可引起酸碱失衡。如甲醇、乙醇等中毒,其在机体代谢产生大量酸性物质,从而引起代谢性酸中毒。一氧化氮可致肺水肿、呼吸窘迫综合征,从而出现动脉氧分压降低;而一氧化氮还可与血红蛋白结合,引起高铁血红蛋白血症。
(九)免疫标记技术
免疫学检测技术是近几十年来发展起来的一门新技术,其一经问世即在临床诊断方面起到重要作用。早在20世纪初人们就开始用免疫方法来检测血型,从20世纪中期发展的免疫标记技术以其高度灵敏度和特异性、快速、定性定量定位均可等优点,目前已成为临床应用最广泛的免疫学检测技术。
免疫标记技术(immunolabelling technique)是用荧光素、酶、放射性核素、铁蛋白、生物素或发光物质作为追踪物,标记抗原或抗体的抗原抗体反应。根据标记物不同,免疫标记技术可分为酶免疫技术、放射免疫技术、化学发光免疫技术、免疫金标技术、荧光免疫技术、免疫印迹技术、免疫沉淀、免疫PCR等,与化学中毒检测相关的主要是前三种,其特点是敏感性高和特异性高(表2-2-12)。
表2-2-12　临床常用的免疫标记技术特点
1.酶免疫技术
指利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原抗体反应检测灵敏性的免疫检测技术,该技术具有标记后保留酶和抗原活性、专一性、酶标试剂稳定、操作简便等特点。酶免疫技术分类如下(图2-2-2),临床最常用的是固相酶免疫测定(ELISA)。
图2-2-2　酶免疫技术分类
ELISA:以免疫学反应为基础,将抗原、抗体特异性反应与酶高效催化作用相结合的一种高灵敏性检测技术。由于抗原、抗体反应在一种固相载体——聚苯乙烯反应板中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过冲洗去除多余游离反应物,从而保证实验结果的稳定性和特异性;由于酶催化效率很高,间接地放大了免疫反应结果,使测定方法达到很高的敏感度。
根据检测物不同,ELISA有不同的方法:检测抗体的间接法,检测抗原的双抗体夹心法,检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法。
实验室常用于ELISA检测的主要有乙肝两对半、各型肝炎抗原或抗体的检测等,在鉴别化学中毒肝损害类型方面有一定意义。
2.放射免疫技术
指利用放射性核素标记抗原或抗体,检测抗体或抗原的免疫标记技术。它又分为两种方法:①竞争性RIA,又称传统RIA,标记的是抗原。甲胎蛋白、癌胚抗原、β 2-微球蛋白等都采用竞争性RIA原理检测。②非竞争性RIA,又称免疫放射分析(IRMA),标记的是抗体。糖类抗原CA50、CA125等采用此法检测。
放射免疫技术灵敏度高,可达1pg,特异性强,实验稳定性好,但其存在一个致命缺陷——放射污染,这一问题不易解决,制约了其发展。免疫发光技术、酶免疫技术的快速发展,将使放射免疫技术逐渐被淘汰。
3.化学发光免疫技术
指将发光系统与免疫反应相结合来检测抗原或抗体的方法,根据检测方法的不同,目前常用的化学发光免疫技术主要有两类:①化学发光标记免疫测定:亦称化学发光免疫测定,是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。②电化学发光免疫测定:标记物为电化学发光反应的底物三联吡啶钌,其衍生物N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯可通过化学反应与抗体或不同化学结构的抗原分子结合,制成标记的抗体或抗原。
最早用于检测的放射免疫分析因标记物的放射性在应用中存在不少问题。为替代这一广泛被采用的测定方法,近年来创立了多种新的标记免疫技术。化学发光免疫测定具有明显优越性:①敏感度高,甚至超过RIA;②精密度和准确性均可与RIA相比;③试剂稳定,无毒害;④测定耗时短;⑤测定项目多;⑥已发展成自动化测定系统。因此化学发光免疫测定在医学检验中不仅能取代RIA,而且可得到更为广泛的应用。
目前,化学发光免疫技术可用于检测激素类如甲状腺激素、生殖分泌激素、生长激素等,肿瘤标志,心肌标志,炎症标志,过敏标志Ig E及各种过敏原检测,多种药物浓度监测等几百个项目。化学中毒出现相应效应损害时,化学发光免疫技术可作为诊断和鉴别诊断的实验室检测方法。
(十)特定蛋白分析仪
目前已发现的血浆蛋白有2000种以上,这些蛋白在病理状态下会发生相应改变,因此在疾病诊断和疗效监测方面具有重要意义。由于蛋白具有某一特定抗原性,目前多采用免疫学方法对其进行检测,因此称为特定蛋白。用于检测这些特定蛋白的仪器称为特定蛋白仪。
特定蛋白仪采用免疫比浊原理测定蛋白含量,其灵敏度可达ng/ml,而生化仪由于方法学的限制只能检测分子量大的蛋白,可以说,特定蛋白仪是生化仪的良好补充。
特定蛋白仪从最初的单一检测项目如C-反应蛋白,发展到现在的全自动特定蛋白检测系统,目前最多可检测70多项。
化学中毒时,机体效应代谢产物包括多种小分子蛋白,如慢性镉中毒时,引起肾小管重吸收功能下降,从而出现蛋白尿,β 2-微球蛋白即可通过特定蛋白仪进行检测。
(十一)流式细胞技术
流式细胞技术是20世纪70年代发展起来的一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析和分选技术。因其具有分析速度快、精度高、结果可靠,以及能同时进行多参数分析等优点而得到广泛应用。
流式细胞仪将待检标本的细胞悬液包裹在鞘液中,使细胞排成单列高速喷出,形成细胞液柱。当细胞液柱通过流式细胞仪检测区,细胞液柱中的细胞在入射的激光束照射下产生前向散射光和侧向散射光,若带有荧光素标记还会发射特定波长的荧光,这些光信号经过光电转换、放大及计算分析处理后,形成分析数据。
具有分选功能的流式细胞仪,先通过分析细胞,确定目的细胞,然后使该细胞液滴成为独立液滴,使其带上相应电量的电荷,其在强电场中发生偏转,进入相应的收集管,即完成分选。
流式细胞仪主要在以下几方面应用:
1.临床免疫学
如免疫状态评价、免疫功能监测、免疫疾病诊断、药物/疫苗效果评价。
2.临床血液学
白血病和淋巴瘤、多发性骨髓瘤、血栓性疾病、血小板减少性疾病、红细胞疾病、干细胞移植检测。
3.临床肿瘤学
肿瘤患者免疫功能检测、肿瘤患者粘附分子检查、细胞DNA倍体分析、细胞周期检测、肿瘤预后估计、疗效监测、多药耐药性检测。
4.血栓与止血
血小板活化分析、血小板膜糖蛋白分析、血小板抗体检测、网织血小板检测、血小板微粒分析。
5.骨髓与器官移植
骨髓或脐血的干/祖细胞测定、移植前配型、移植后的免疫监测。
6.基础医学研究
造血干祖细胞扩增及保存、肿瘤发生和发展、药物治疗机制研究、基础免疫学研究、免疫状态评价。
在化学中毒方面,流式细胞术在评价患者免疫状态和肿瘤鉴别方面具有重要应用价值。
(十二)聚合酶链反应技术
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法,它模拟核酸分子体内复制过程,在聚合酶的作用下,进行特定核酸片段体外复制。
PCR技术是1985年由Cetus公司和加利福尼亚大学联合发明的,主要贡献者为Karymulis和Henery A、Erlich。其可将极微量靶DNA特异性地扩增上百倍,从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力,能检测每10万个细胞中仅含有一个靶DNA分子的样品,因而发明人Karymulis获得1993年诺贝尔化学奖。
PCR扩增DNA的原理是先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链,然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物,引物与互补DNA结合后,以靶DNA单链为模板,经反链杂交复性(退火),在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷(d NTP)为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增,直至扩增到能检测到的量,一般扩增30～35个循环。
自1985年首次报道PCR方法以来,PCR被广泛应用于分子克隆、序列分析、基因突变、遗传病、传染病、性传播性疾病及法医判定和考古研究等多领域,并发挥了越来越大的作用。
化学中毒,尤其是慢性化学中毒的遗传易感性研究方面,PCR技术具有重要意义。
三、效应检验质量保证
实验室是为临床提供诊断和疗效监测数据的科室,实验室工作直接与患者生命息息相关。为了使检验结果更好地反映患者实际情况,必须对检验全过程,包括从临床医师开出检验单到患者准备、标本采集、标本运送、标本处理、标本分析及结果处理,直至最后发出报告进行全面质量控制(图2-2-3)。即实验室和医院各有关科室必须互相配合,为控制可能出现的各种误差和差错,采取各种行政和技术上的措施和方法,这称为医学检验质量保证。
图2-2-3　医学检验的质量保证
医学检验质量保证不仅仅是检验科一个科室的责任,临床医生、采血护士、标本及报告单运送者、甚至患者准备情况均影响检验结果的质量。因此,医学检验质量控制分为检验前质量保证、检验中质量控制和检验后质量评估。检验前质量保证前已述及,本节简要介绍检验中质量控制的一些基本原则。
(一)正态分布
正态分布曲线是以均数为中心、左右完全对称的钟型曲线,它表示变量值出现的概率。正态分布主要用于:
1.估计参考值范围
医学上通常将 ±1.96s表示95%数据所在范围作为参考值范围 [31]。
2.质量控制
为了控制实验中的测量(或实验)误差,常以 ±2s作为上、下警戒值,以 ±3s作为上、下控制值 [32]。
3.正态分布
是许多统计方法的理论基础。检验、方差分析、相关和回归分析等多种统计方法均要求分析的指标服从正态分布。许多统计方法虽然不要求分析指标服从正态分布,但相应的统计量在大样本时近似正态分布,因而大样本时这些统计推断方法也是以正态分布为理论基础。
(二)室内质量控制
《临床实验室质量保证的要求》(WST 250-2005) [33]指出:室内质量控制是实验室内为达到质量要求所进行的操作技术和活动。室内质量控制的目的是监测实验室整个检验过程,评价检验结果是否可靠,以及排除质量环节中所有导致不满意结果的原因。
1.质控图
质控图是对检验过程质量进行测定、记录从而评估和监测过程是否在控的一种统计图(图2-2-4)。最常用的是Levey-Jennings质控图 [34]。
图2-2-4　质控图示例
20世纪50年代Levey和Jennings将工业生产中的Shewhart质控图引入临床检验中,后来Herry和Segalove又对Levey-Jennings质控图做了部分修改,以20份质控物检测结果,计算其均值和标准差,定出质控限(一般 x±2s为警告限, x±3s为失控限),每批随常规样品测定质控物,将所得的质控物结果标注在质控图上。因历史和习惯,仍将修改后的质控图称为Levey-Jennings质控图(图2-2-5) [34]。
2.常用质控规则
质控规则是解释质控数据和判断分析批质控状态的标准。以符号A L表示,其中A是质控测定值个数或超过质控限(L)的质控测定值个数,L是质控限。当质控物测定值达到规则要求的条件时,则判断该分析批违背此规则。例如1 2s质控规则,其中质控测定值个数(A)为1,质控限(L)为 ±2s。1 2s表示有一个质控测定值超过 ±2s时,即判断为失控。
常用质控规则的符号和定义如下 [34]:
图2-2-5　Levey-Jennings质控图
(1)1 2s:
1个质控物测定值超过 ±2s质控限。常用作Levey-Jennings质控图上的警告界限。
(2)1 3s:
1个质控物测定值超过 x±3s质控限。此规则对随机误差敏感。
(3)2 2s:2
个连续的质控物测定值同时超过 +2s或 -2s质控限。此规则主要对系统误差敏感。
(4)R 4s:
在同一批内最高质控物测定值与最低质控物测定值之间的差值超过4s。此规则主要对随机误差敏感。
(5)4 1s:
4个连续的质控物测定值同时超过 +1s或 -1s。此规则主要对系统误差敏感。
(6)9 :
9个连续的质控测定值落在平均值 )的同一侧。此规则主要对系统误差敏感。
(7)10 :
10个连续的质控测定值落在平均值 )的同一侧。此规则主要对系统误差敏感。
(8)比例质控规则(m of n) L:
最常用的是(2 of 3) 2s规则,即连续三个质控物测定值中有两个质控物测定值超过 +2s或 -2s质控限。
3.多规则质控方法
选择两个或多个质控规则,以提高误差检出概率和降低假失控率。Westgard等人推荐以下6个基本质控规则,即1 2s、1 3s、2 2s、R 4s、4 1s和10 ,称为“Westgard规则”。1 2s规则作为警告规则启动其他的质控规则来检查质控数据。如果没有质控数据超过2s质控限,则判断分析批在控,并且可报告患者结果。如果1个质控数据超过2s质控限,应由1 3s、2 2s、R 4s、4 1s和10 规则进一步检验质控物测定值,如果没有违背这些规则,则该分析批在控;如果违背其中任一规则,则判断该分析批为失控(图2-2-6和图2-2-7) [34]。
图2-2-6　应用1 3s/2 2s/R 4s/4 1s/10 系列质控规则的逻辑图
图2-2-7　修改的1 3s/2 2s/R 4s/4 1s/10 多规则质控方法
4.失控处理及原因分析
操作者如发现质控物测定结果违背了质控规则,应记录失控情况,上交专业主管,由专业主管做出是否发出与失控相关的患者结果的决定。
对失控的处理是要查找失控原因并提出妥善解决办法,消除失控原因并防止以后再次发生。寻找失控原因及处理的步骤如下(图2-2-8) [34]:
(三)室间质量评价
在实验室质量保证中,室间质量评价(external quality assessment,EQA)越来越受到实验室重视。室间质量评价是多家实验室分析同一样本并由外部独立机构收集和反馈实验室上报结果以评价实验室操作过程。
20世纪30年代,美国疾病控制中心为保证不同实验血清学梅毒检测准确性和可比性,首次在一定范围内开展了室间质量评价。20世纪40年代以来,美国病理学家学会逐步发展成为全世界最大的室间质量评价组织者,开展了临床化学、临床免疫、临床血液体液学、临床微生物、分子生物学等多种室间质量评价计划,已有上万家实验室参加了它的质量评价计划。
我国卫生部临床检验中心从1982年成立以来,逐渐建立了国内最大的室间质量评价计划,各省临床检验中心也相继建立了本省的室间质量评价计划,室间质量评价计划覆盖了全国县级以上医院检验科,为我国实验室检验质量提供了保证。
我国室间质量评价采用盲样考核方式,将考核样品发放至实验室,实验室按常规在规定日期检测后将结果反馈到室间质量评价组织者,组织者统计分析评价结果,并反馈至实验室。
室间质量评价不仅评价实验室检测能力,并帮助实验室发现质量问题并采取相应改进措施,改进分析能力和实验方法,而且室间质量评价是实验室质量保证的重要外部监督工具。
图2-2-8　失控处理步骤

(张艳芳)

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