第一节　赤霉素及其对植物茎伸长生长的调控

赤霉素（gibberellin，GA）调控植物体生长发育的许多进程，如种子的萌发［16］、叶片的扩展［17］、茎的伸长［18］、开花以及果实发育等［19］。GA对高等植物最突出的作用是在很低的浓度下就可以刺激茎的伸长生长，使植株明显增高，但并不改变节间数目。在一定浓度范围内，随处理浓度的增加，刺激生长的效应也增强。研究发现，赤霉素促进植物生长的主要原因，是由于它能明显促进细胞的分裂和伸长。研究表明，GA缺失突变体和GA不敏感突变体在植株生长上都受到影响，这些突变体植株伸长生长都受到抑制，植株表现出不同程度的矮化［20， 21］。

一、赤霉素的生物合成

1.赤霉素前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸生物合成

甲羟戊酸（mevalonic acid，MVA）是水稻和其它高等植物中GA生物合成的最初前体［22］。甲羟戊酸是乙酸被乙酸硫激酶激活形成乙酰-CoA［23］，经硫解酶的催化，两个乙酰-CoA分子发生缩合反应生成乙酰乙酰-CoA，在3-羟基-3-甲基-戊二酰-CoA合酶和3-羟基-3-甲基-戊二酰-CoA还原酶的作用下形成3-羟基-3-甲基-戊二酰-CoA和产物MVA［24］。MVA经过加磷酸基团反应和脱羧反应形成异戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）；IPP在IPP异构酶的作用下可逆异构化形成二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），它与一个IPP分子在牻牛儿基焦磷酸合酶催化下，头尾相连形成C10 中间产物牻牛儿基焦磷酸（geranyl pyrophosphate，GPP），后者与另一个IPP分子缩合为法呢基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP），并进一步与第3个IPP分子在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶的作用下缩合为C20 中间产物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（trans-geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）。也有人认为3-磷酸甘油醛/丙酮酸盐是赤霉素合成最初前体［25］，因为某些藻类以及高等植物可以将3-磷酸甘油醛或者丙酮酸盐转化成异戊烯焦磷酸（IPP）［26， 27］，这一途径主要存在于质体中，它与甲羟戊酸途径的不同点在于IPP的形成方式不同。在叶绿体中，IPP是由丙酮酸在转酮酶的作用下，提供二碳单位给甘油醛-3-磷酸而形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸，再经分子重排形成IPP或DMAPP。从IPP 到GGPP的合成甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸途径是一样的。

2.赤霉素生物合成的三个阶段

如图2.1所示，根据反应类型和酶的种类，可将GA的生物合成主要分成3个阶段 ［28～31］。

第一阶段， GGPP合成内根-贝壳杉烯（ent-kaurene）。这些反应是在前质体中进行的，有关的酶是可溶性的酶，不与膜结合。在古巴焦磷酸合成酶（ent-copalyl pyrophosphate synthase，CPS）的催化下，GGPP环化形成古巴焦磷酸（ent-copalyl pyrophosphate，CPP），后者在内根-贝壳杉烯合成酶（ent-kaurene synthase，KS）催化下环化成为赤霉素的前身——内根-贝壳杉烯。

第二阶段，内根-贝壳杉烯氧化为 GA12-醛（GA12-aldehyde）。这些反应是由与微粒体膜结合的依赖细胞色素P450的单加氧酶（monooxygenase）催化的，需要O2和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。内根-贝壳杉烯转化为内根-贝壳杉烯醇（ent-kaurenol）、内根-贝壳杉烯醛（ent-kaurenal）、内根-贝壳杉烯酸（ent-kaurenoic acid）、内根-7α-羟-贝壳杉烯酸（ent-7α-hydroxykaurenoic acid）再到GA12-醛。

第三阶段，GA12-醛进一步氧化为不同的GA。首先把GA12-醛的C-7醛基氧化成羧基，成为GA12，再将C-20的甲基氧化成羟甲基，成为GA53。GA53和GA12在GA 20-氧化酶（GA 20-oxidase）和GA 3-氧化酶（GA 3-oxidase）作用下，分别形成有生物活性的GA1和GA4。它们在GA 2β-羟化酶（GA 2β-hydroxylase）的作用下，转变为无生物活性的GA8和GA34。这3种酶都是双加氧酶（dioxygenase），需要2-酮戊二酸（2-oxoglutaric acid）和氧分子作为辅底物（cosubstrate），Fe2+和抗坏血酸为辅因子（cofactor）。与此同时，GA53和GA12也会转化为各种GA。

二、赤霉素代谢对植物茎伸长生长的调控

1.赤霉素合成受阻抑制植物茎伸长生长

如图2.2所示［32］，已经有很多赤霉素合成突变体被筛选鉴定出来了。这些突变体共同的特点是：内赤霉素合成途径中的基因发生了突变，导致赤霉素合成受阻，因而体内活性赤霉素的含量降低，从而抑制了植株的生长，导致植株表现出不同程度的矮化。

GA1基因所编码的ent-kaurene synthetase A酶能够催化GGPP→CPP的转化，GGPP→CPP的转化是植物体合成赤霉素第一个关键的步骤。GA1基因发生突变产生了一些赤霉素缺失型的拟南芥突变体（表2.1）［33］，这些突变体内赤霉素的合成在GGPP→CPP步骤被阻断，植株体内严重亏缺赤霉素导致矮化；但是，它们都能够响应外源的赤霉素。ga1-3是ga1突变体的一种，ga1-3因为亏缺赤霉素导致植株不能正常生长［34］。不过，利用在野生型拟南芥中克隆到的GA1 cDNA转入到ga1突变体中能够恢复其矮化表型［33］。

ga2是赤霉素缺失型的拟南芥突变体，该突变体中KS缺乏活性。KS是催化CPP→ ent-kaurene的关键酶。ga2突变体缺乏KS活性导致赤霉素合成在CPP → ent-kaurene被阻断，导致ga2突变体内缺乏赤霉素，从而引起植株矮化。然而，利用在南瓜（Cucurbita maxima）中克隆到的CmKS cDNA转入到ga2突变体中能够恢复该突变体的矮化表型［35］。

GA3基因编码ent-kaurene oxidase（KO），KO是催化赤霉素合成ent-kaurene → ent-kaurenoic acid［36］。ga3 是GA3 基因突变产生的拟南芥缺失型突变体，该突变体也因为赤霉素合成受阻导致体内赤霉素含量降低、植株矮化。ent-kaurene synthetase A、KS 和 KO 分别由GA1、GA2和 GA3三个单独的基因编码，这三个基因突变后分别产生的突变体 ga1、ga2和ga3的赤霉素合成严重受阻，导致内源赤霉素含量很低，从而引起植株矮化。不过，GA4和GA5基因突变所产生的拟南芥突变体（ga4和 ga5）仅仅表现为半矮化。GA4 和 GA5 能够分别编码GA 3-oxidase和GA 20-oxidase，但是GA 3-oxidase和GA 20-oxidase 都是分别由好几个GA3ox基因和 GA20ox基因共同表达的产物，所以即使GA4和GA5 基因突变了，其余几个GA3ox基因和GA20ox基因的表达能够部分地弥补GA 3-oxidase和GA 20-oxidase的活性［37］。因此，ga4和ga5体内有部分赤霉素的合成，所以植株表现出半矮化。

注：下划线表示每个突变体中的碱基替换。

上面介绍的是赤霉素合成受阻的拟南芥突变体。此外，在其它植物体中也发现了很多赤霉素合成受阻的突变体（图 2.2）。这些突变体都表明：赤霉素合成途径中某些步骤受阻会导致植株伸长生长受阻，外源赤霉素处理能够促进这些突变体伸长生长。因此，赤霉素是植物伸长生长所必需的。

2.赤霉素过量合成促进植物茎的伸长生长

在植物体中，催化赤霉素合成的一些关键酶活性升高会引起植物体大量合成赤霉素，从而促进植物体高度伸长。Huang等［38］报道：GA 20-oxidase 是催化赤霉素合成的关键酶，在插入一个cDNA片段（该片段能够高度表达GA 20-oxidase）的转基因拟南芥中发现活性GA1含量显著升高，GA1的大量合成促使转基因植株高度伸长，导致转基因植株最终的高度是其对照的3倍多。

3.活性赤霉素钝化减弱促进植物茎的伸长生长

内源活性赤霉素的含量不但受控于赤霉素的生物合成，还受控于活性赤霉素的异化作用（活性赤霉素的钝化）。水稻 ELONGATED UPPERMOST INTERNODE（EUI）基因能够编码细胞色素P450单加氧酶，而细胞色素P450单加氧酶能够催化活性赤霉素环氧化，从而促使活性赤霉素发生钝化。在野生型水稻植株中，赤霉素的生物合成与其钝化作用存在着一定的平衡关系，因而植株中活性赤霉素的含量维持在一个能够调控植株正常生长的水平。然而，Zhu 等［39］指出：在突变体eui植株中，因为活性赤霉素钝化受阻导致活性赤霉素的含量显著高于野生型。正常水稻倒一节间中活性GA4含量很低，用 GC-MS 方法没能测出 GA4 的含量；然而，在eui突变体中活性 GA4的含量极高，而且eui突变体中活性GA1的含量也显著高于野生型。因此，eui突变体植株显著伸长，eui突变体倒一节间长度高达野生型倒一节间长度的2倍左右。在EUI 高度表达的转基因植株EUI-OX中，活性赤霉素钝化作用极强，使得EUI-OX植株中活性赤霉素含量极低，导致了EUI-OX植株伸长生长严重受阻，从而引起矮化。

4.活性赤霉素钝化加强导致植物茎的伸长生长受阻

GA 2-oxidase（GA2ox）能够调控植物活性赤霉素向非活性赤霉素（GA4→GA34，GA1 → GA8）的转化。GA2ox 在调控植物体内源活性赤霉素含量中起了很重要的作用，GA2ox 表达水平升高会引起活性赤霉素钝化的加强，从而降低活性赤霉素的含量。Schomburg 等［40］试验表明：在正常的拟南芥植株中AtGA2ox7和AtGA2ox8几乎都不表达；然而在AtGA2ox7和AtGA2ox8被激活表达的突变体AtGA2ox7ACT 和 AtGA2ox8ACT中，赤霉素钝化作用得到了加强，导致突变体AtGA2ox7ACT 和 AtGA2ox8ACT的伸长生长受阻，从而引起植株矮化。转了AtGA2ox7和AtGA2ox8的转基因植株也因为内源活性赤霉素钝化的加强产生矮化现象。

此外，与野生型水稻相比，携带Act：OsGA2ox1的转基因水稻中活性赤霉素GA1的含量降低了75%，而GA8的含量是野生型的2.5倍。GA1是水稻营养生长的控制因子，因此携带Act：OsGA2ox1的转基因水稻由于GA1钝化作用的加强而引起GA1的亏缺，从而导致植株伸长生长严重受阻产生矮化表型［41］。

三、赤霉素信号转导对植物茎伸长生长的调控

植物体内存在赤霉素信号传递网络。赤霉素受体感知GA信号后，激活信号传递通道中的各基因表达，从而调控植株的生长发育。当编码这些信号因子的基因或者是它们所识别的顺式作用位点发生突变时，其下游基因的表达和相关蛋白间的相互作用就会发生相应的变化，从而导致植物对GA的响应发生改变。近年来，随着对模式植物拟南芥和水稻基因组的测序及其突变体的大规模筛选，人们对赤霉素信号转导途径有了更深入的了解。

（一）赤霉素信号转导途径主要组分及其调控功能

1. DELLA蛋白

在模式植物拟南芥中，隐性的功能缺失突变体gai和rga能够部分地恢复赤霉素缺失突变体以及赤霉素抑制剂处理的植株所引起的缺乏赤霉素的表型［42， 43］。GAI 和 RGA 具有很高的同源性，它们都是核内的转录调控因子。在拟南芥中发现了5个 GAI/RGA 相关基因，它们是GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3 ［44， 45］。研究表明，GAI、RGA、RGL1、RGL2都是赤霉素信号转导负调控因子，目前 RGL3的功能还不清楚［46］。

在拟南芥中，GAI、RGA 以及类似的同源蛋白被称为 DELLA蛋白，DELLA 蛋白是属于GRAS家族的成员，可能是转录抑制子，它们都具有N-端的 DELLA 域、中部的 VHIID 区和 C 端的 RVER 域［46， 47］。DELLA 蛋白是GA信号转导阻遏物，RGA 和 GAI 可单独或共同调节 GA 信号转导。在GA 诱导的 DELLA 蛋白转录后磷酸化修饰中 DELLA 域可能起着重要作用。

具有生物活性的 GA 是通过削弱 DELLA 蛋白的抑制作用来调控植物的生长发育的。DELLA 功能缺失突变体可抑制赤霉素缺失突变体 ga1-3 的表型［48］。gai-1 突变体是一种表型为 GA 不敏感的矮小个体。gai-1显性等位基因缺失了包括一个开放阅读框在内的51个碱基，可能编码一个 gai-1 突变蛋白，该蛋白产物在保守的 DELLA 区中少了17个氨基酸［42］。含有 rga-Δ17 或 rgl1的转基因植物编码的 rga 或 rgl1 蛋白可能在高度保守的 DELLA 域中都缺少17个氨基酸，并表现出 GA 不敏感性矮化［49， 50］。实验表明，GA 是通过可诱导野生型拟南芥 GAI 和 RGA 蛋白快速降解，使得响应 GA 的一些基因得以表达，从而完成 GA 对植物生长发育的调节作用［51］。

在水稻上，Ikeda 等［52］报道了SLR1 功能完全缺失突变体 slr1-1具有组成型响应赤霉素的表型，SLR1基因和GAI/RGB/RHT/D18 具有很高的同源性。目前为止，SLR1蛋白是在水稻中已经报道的唯一的 DELLA 蛋白。虽然slr1-1突变体内活性赤霉素含量很低，对赤霉素也不敏感，但植株却高度伸长；赤霉素抑制剂烯效唑（uniconazole）不能抑制slr1-1突变体的生长。

2. SCFSLY1 E3 Ub 复合体

SLY1 蛋白是一个含有151个氨基酸的 F-BOX 蛋白，其 N-端有 F-box 基序［53］。在sly1 突变体中，RGA 的蛋白水平都显著提高，而且外源赤霉素处理不能诱导sly1 突变体中 RGA 蛋白的降解，从而导致植株伸长严重受阻；然而外源 GA 处理能够促使 RGA 蛋白的降解（图2.3），从而促进植株伸长。SLY1 已经被假定为SCFSLY1 复合物的一部分，GA信号刺激能够促使 SLY1 和 DELLA 蛋白识别并结合，而且能够直接相互作用，这个过程是通过 DELLA 蛋白的C-端 GRAS 结构域所介导［54， 55］。SLY1 在 DELLA 蛋白的降解过程中起了很重要的作用。rga 和gai 的等位基因共同突变后，可完全抑制 sly1的矮化表型［53， 55］。三重突变体（sly1/rga/gai）能生长，但花发育不正常，说明 SLY1 在 GA 诱导 RGL 蛋白的降解中也起作用。酵母双杂交实验表明，SLY1 与 RGA 能够直接相互作用，SLY1 能够把 DELLA 蛋白募集到SCFSLY1 E3 Ub 复合体上，进而降解它；酵母双杂交实验也表明 GAI 具有与 SLY1 相互作用的结构域［55］，但 DELLA 域并不是 GAI/RGA 与 SLY1 相互作用的必需基团，酵母中 GAI 的 GRAS 域单独就可以和 SLY1 作用。

（二）赤霉素信号转导途径

Sun［33］和 Thomas［34］已经在拟南芥上提出 GA 信号转导模型（图2.4）。DELLA 基因（GAI、RGA、RGL1、RGL2、RGL3），可能是下游的 GA 应答基因的关键抑制子。在拟南芥中，DELLA 蛋白在调控 GA 介导的植物生长发育各方面都起着重要作用。具有生物活性的 GA 被一个假定的原生质膜上的受体所感知，进而引起信号级联反应。在水稻上研究发现，信号级联反应的早期阶段涉及DELLA 蛋白磷酸化激酶的激活以及翻译后的一些修饰过程。DELLA 域被推测在感知 GA 信号过程中起作用。随后，SCFSLY1 E3 Ub 复合体通过 GRAS 域的 SLY1 亚基识别并连接被修饰过的 DELLA 蛋白，很多的 DELLA 蛋白被募集到 SCFSLY1 E3 Ub 复合体上就形成 DELLA 的遍在蛋白多聚体，这些多聚体能够被26S蛋白酶体识别并降解。DELLA 蛋白水平的降低允许下游一些基因的表达，进而植株响应 GA 促进生长发育。

四、赤霉素促进植物茎伸长生长的机制

植物茎的伸长源于细胞数目的增加和细胞伸长。赤霉素能够显著地促进植物茎的伸长可能与增加细胞分裂、促进细胞壁松弛和增加细胞渗透吸水有关。

（一）赤霉素促进细胞分裂

研究表明，赤霉素能够促进细胞分裂［2～4］。Bleecker 等［56］报道，赤霉素或淹水处理能使深水稻最上节间居间分生组织的细胞分裂周期从24h缩短到7h，加快了新的细胞产生的速率，从而使得细胞数目比对照增加2倍。随后，Lorbiecke 和Sauter的试验［57］表明：在细胞分裂间期1（G1）向DNA合成期（S）过渡阶段，赤霉素或淹水处理能够诱导cdc2Os-2（一种细胞周期蛋白基因）和Histone H3（一种组蛋白基因）的表达；在细胞分裂间期2，赤霉素或淹水处理能够提高细胞周期蛋白基因cycOs1和cycOs2的转录水平。

（二）赤霉素促进细胞伸长

1.赤霉素促进微管与细胞长轴呈垂直排列

植物细胞壁的主要组成是纤维素，呈晶形微纤丝，这种微纤丝无伸展性，所以，当微纤丝与细胞伸长的方向平行时就会抑制细胞伸长；当微纤丝与细胞伸长的方向垂直时细胞就存在伸长的潜力。研究表明，微纤丝在细胞壁中的取向由分布于质膜内侧的微管的排列方向所控制，并与微管的排列方向平行；GA处理能够促使微管的排列方向与生长着的细胞长轴垂直［58］，从而有利于细胞伸长。

2.赤霉素提高木葡萄糖内转葡萄糖基酶的活性

木葡萄糖类（xyloglucans）是植物初生壁的主要成分之一。木葡萄糖除了受纤维素酶催化外，还受木葡萄糖内转糖基酶（xyloglucanen-dotransglycosylase，XET）作用。研究表明XET可以使木葡萄糖产生内转基作用，把木葡萄糖切开并重新形成另一个木葡萄糖分子，再排列为木葡萄糖-纤维素网，从而使细胞壁延长［59］。GA 能显著提高XET 的活性［60］。 在水稻上已经报道了4种 XET 相关基因（OsXTR1、OsXTR2、OsXTR3、OsXTR4），其中OsXTR1和OsXTR3主要在节间伸长区表达［61］。Uozu 等［61］实验结果显示：水稻矮秆突变体（Akibare D 和 Waito C）节间中OsXTR1、OsXTR3mRNA水平很低，而OsXTR2、OsXTR4 mRNA水平和野生型几乎没有差异；外源GA3处理能够提高这两种突变体节间中OsXTR1、OsXTR3表达水平，并使它们的 mRNA 水平接近野生型，从而促进节间细胞伸长、促进矮秆突变体节间伸长，这一结果说明了GA3是通过提高XET相关基因的转录水平促进细胞伸长的。

3.赤霉素诱导膨胀素的产生并增加其活性

膨胀素（expansin）能够通过断裂细胞壁多聚体间（如微纤丝和半纤维素间）的非离子键，引起细胞壁松弛从而促进细胞伸长。已有充分证据表明膨胀素是促进细胞伸长的关键因子［62］。研究表明［62， 63］，外源GA处理能够促进水稻节间中膨胀素基因Os-EXP4 mRNA 的积累，随后节间细胞迅速伸长引起节间伸长，这一结果说明外源GA促进细胞伸长是通过诱导膨胀素的产生并增加其活性来实现的。