1.4　磷脂脂肪酸生物标记法研究进展

1.4.1　磷脂脂肪酸分析法及其命名原则

土壤是微生物栖息最重要的生活环境之一，研究者认为80%～90%土壤中发生的反应都有着微生物的作用，土壤微生物对于外界环境变化的反应非常敏感，其性质经常被用作评价土壤是否健康的灵敏性指标。土壤微生物直接或间接参与土壤活动中，通过改变土壤的生物学特性等，在分解转化有机物、转化和供应养分中有重要作用，维系了生态系统物质和能量的正常循环。因此，土壤微生物的多样性常被用来评价土壤质量，可以提供与土壤质量相关的信息，从而更好地评价土壤的生态情况。

土壤微生物多样性的传统测试方法是分离法，但该方法可分离鉴定的微生物很少，只有全部土壤微生物的0.1%～1%。其方法也存在研究成本高、工作量大的缺陷。随着测试技术的进步，出现了磷脂脂肪酸（PLFA）分析法、生物标志物法和核酸分析法等能更好地评价土壤微生物多样性及其群落结构的方法。PLFA是生物膜中相对恒定比例的基本膜组件，环境变化会使脂肪酸比例发生变化，把活的微生物细胞膜中磷脂脂肪酸作为生物标记引入，鉴定并识别土壤微生物类群，准确而且稳定，该技术易于操作、快捷高效、信息量大，被广泛地应用于土壤微生物群落研究。

PLFA生物标记法是常见的生物化学方法，由于PLFA是活体细胞膜的重要组成部分，且在细胞内的含量和成分相对稳定，不同类群的微生物可以经过不同的生化途径进而合成不同的PLFA，使其具有特异性，活体细胞死亡之后PLFA很快就会分解，所以检测到的PLFA大体上可以反映土壤中活体微生物的数量以及群落结构，因此可以通过分析PLFA谱图中不同PLFA的种类和含量来表示不同土壤微生物类型和确定生物量。

根据现有文献（不同研究中不同类群的微生物的特征PLFA可能会有所有重叠）分类，如a15：0、15：0、i15：0、16：0、i16：0、16：1ω5、16：1ω7t、16：1ω9、a17：0、17：0、i17：0、cy17：0、18：1ω5、18：1ω7、a19：0、i19：0、cy19：0等可以用来指示细菌，革兰阳性（G+）菌含有多种分枝脂肪酸，革兰阴性（G-）菌含有多种羟基脂肪酸，15：0、i15：0、a15：0、i16：0、16：1w7t、16：1w9、17：0、i17：0、a17：0等可以用来指示好氧菌，18：1w7c可以指示厌氧菌，18：2w6c、18：3w3c、18：3w6c等用来指示真菌，10Me18：0用来指示放线菌等。PLFA的提取和测定是此分析方法的关键步骤，PLFA的提取主要采用PLFA法、EL（Ester- Linked Extraction Method）提取法或TSFAME（Total Soil Fatty Acid Methyl Esters）提取法、MIDI（美国微生物检测系统）提取法，目前基本都采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）用于PLFA的测定。

由于土壤中许多微生物是不能被分离培养的，而非培养的PLFA分析方法打破了这种局限，对样品保存和实验条件要求低，且脂肪酸相对稳定，在一定程度上PLFA生物标记法提高了实验结果的准确性，所以在土壤微生物生态学方面得到了越来越多的应用。但是这种方法仍有很多不足，比如该方法不能从种或株的水平上描述微生物；目前仍不清楚所有的特征PLFA，所以很多存在的特殊脂肪酸并不能用来指示特定的微生物；不能用此方法来分析古菌等。

PLFA分析法是一种分析微生物群落结构的方法，它的依据是所测定的土壤微生物PLFA的种类和含量是不同的，这是一种基于非培养的微生物群落的测定方法。有关PLFA的来源，是一个相对性的划分，划分的依据是其在同类群微生物中的呈现概率和稳定性及专一性，意在通过它们来反映土壤中微生物的变化。样品磷脂构成的变化能对微生物群落来进行定性的识别和定量的描述，是一种快捷、可靠的检测方法。该方法的测试流程主要包括提取、纯化、甲脂化和气象色谱测定，PLFA的提取一般使用Bligh和Dyer法。

PLFA的命名通常是以总碳数：双键个数和双键距分子末端的位置命名：简写符号可表示为（a/i）X：Y ω Z（c/t）。其中，a和i分别表示支链的反异构和异构，c表示顺式，t表示反式，ω表示双键的位置，X表示总碳数，Y表示双键个数，Z表示双键的位置在第Z个碳原子上，特别的，环丙烷脂肪酸用cy表示，10Me表示有一个甲基团在距羧基末端的第10个碳原子上。

1.4.2　磷脂脂肪酸分析法的原理及其应用

PLFA分析法的原理就是基于磷脂几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分，细胞中的磷脂含量在自然条件下是恒定的。但是PLFA只能代表微生物群落中存活的群体部分，其原因是在细胞死亡以后，磷脂很快就会被分解掉。

国内外使用PLFA技术对微生物进行的生态学研究中，PLFA可用于估算微生物量，可确定群落结构和指定特定微生物，通过PLFA分子链中第一个官能团和侧链结构可以知道微生物的类型，可以帮助确定微生物群落组成。

常见的PLFA的鉴定有美国微生物检测公司（MIDI，U.S.）开发的Sherlock MIS系统、气相色谱质谱法、液相色谱质谱法等。Sherlock MIS系统采用保留时间锁定功能，直接测定样品中保留时间介于九烷酸甲酯和二十烷酸甲酯之间的短链脂肪酸，操作简单，成本低，分析效率高。但数据库未完善，结果分析不够精准，有局限性。

液相色谱质谱法则没有相应的数据谱库来对比查询，需自行建库进行分析，而且这种方法较多地被应用于食品分析中，在土壤样品检测中应用很少。

气相色谱质谱法需要采用标准物质进行定量和定性分析。该方法检出限较低，灵敏度比较高，可以弥补Sherlock MIS系统中缺点，识别出Sherlock MIS系统中不包括的PLFA。