第二节　中药分析与检测的基本程序

中药分析与检测工作的程序一般为取样、待测样品的制备、待测样品的鉴别与检查以及含量测定等。

一、取样

药品的分析都有取样问题。取样虽简单但非常重要。要从大量的待测品中取出少量样品进行分析，要考虑到取样的代表性、科学性和真实性，否则将会影响到检测结果的正确性。因此，抽取样品前，应注意药材的品名、产地、规格、等级和包件式样是否一致，检查包装是否完整、清洁以及有无水迹、霉变或其他物质污染等情况，并详细记录。凡有异常情况的包件，应单独检验。取样的原则应是均匀、合理且有代表性。下面主要介绍药材和中药制剂取样的方法。

1.中药材取样方法

（1）同批药材包件中抽取检定用样品，原则如下：

①药材包件数在100件以下的，随机取样5件；

②包件数在100～1000件的，按5％取样；

③包件数超过1000件的，超过部分按1％取样；

④包件数不足5件的，要逐件取样；

⑤贵重药材，包件不论多少必须逐件取样。

（2）对已破碎的及粉末状的或大小在1cm以下的药材，可用取样器取样，每包件要在不同部位抽取2～3份样品；包件少的抽取总量要不少于实验用量的3倍；包件多时，每包件取样量是：一般普通药材100～500g；粉末状药材25g；细贵药材5～10g；个体大的药材，根据实际情况抽取具有代表性的样品。如药材的个体较大时，可在包件不同部位（大包件的应从10cm以下的深处）分别取样。

（3）将抽取的样品混合均匀，即为总样品。对个体较小的药材，应平摊成正方形，依对角线划“×”形，使分为四等份，取对角两份；再如上操作，反复数次至最后剩余的量足够完成所有必要的试验及留样数为止，此为平均样品。个体大的药材，可用其他方法取平均样品。

（4）平均样品的量不得少于试验所需量的3倍，即1/3供实验室分析用，1/3供复核用，剩下1/3供留样保存，保存期至少1年。

2.中药制剂取样法

中药制剂的取样也应有代表性、科学性和真实性，取样量应为至少可供3次检验的用量。细贵药可酌情取样。

（1）粉末状中药制剂　如散剂、颗粒剂，一般取样100g，可从包装的上、中、下3层或间隔相等部位取样。将取出的供试样品混匀，然后按“四分法”从中取出所需供试量。

（2）液体中药制剂　如口服液、酊剂、酒剂、糖浆，一般取样量为200mL，对底部有沉淀的液体制剂应在摇匀后再取样。

（3）固体中药制剂　如丸剂、片剂，一般片剂取量为200片，未成片前已制成颗粒的可取100g；大蜜丸一般为10丸，水蜜丸、水丸取所需量的10～20倍，将取得样品粉碎混匀后，再按“四分法”从中取出所需供试量；胶囊按药典规定取样不得少于20粒胶囊，倾出其中药物并仔细将附着在胶囊上的药物刮下，合并混匀，再称定空胶囊的重量，由原来的总重量减去，即为胶囊内药物的重量，一般取样量为100g。

（4）注射剂　取样需经过2次，配制后在灌注、熔封、灭菌前取样一次，取样量为200mL，经灭菌后再取样一次，取样量一般为200支。

（5）其他剂型　其他剂型的中药制剂，可根据具体情况抽取一定数量作为随机抽样。

二、待测试样品的制备

（一）待测试样品的提取

1.溶剂提取法

溶剂提取法是根据中药材和中药制剂中各种化学成分在溶剂中的溶解性，选用对有效成分溶解度大、对无效成分溶解度小的溶剂，使有效成分从药材组织中尽可能地溶解出来的方法。是最常用的提取方法。

（1）溶剂提取法的原理　当所选用的溶剂接触天然药物原料时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁进入到植物组织细胞内，溶解大量可溶性物质，造成了细胞内外浓度差而产生渗透压，使细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材原料组织中，可溶的成分不断被溶解出来。如此反复多次，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡为止。将此溶液倾出过滤，再多次加入新溶剂，直至所需成分全部或大部分溶出。

此法的关键就是如何根据所提取成分的性质选择适宜的溶剂。溶剂通常可分为水、亲水性有机溶剂及亲脂性有机溶剂。常用亲水性有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等，亲脂性有机溶剂有三氯甲烷、苯、石油醚等。

常见溶剂的亲水性或亲脂性的强弱顺序如下：

选择溶剂时，溶剂的亲水性和亲脂性要与所需提取成分性质相适应，而天然药物中的化学成分也有亲水性和亲脂性之分。化合物亲水性基团越多（如：羧基、羟基、含氧基团等极性基团），其极性就越大，表明为亲水性；而亲水性基团少者，则表现为亲脂性。这种亲水性和亲脂性的程度和大小，主要取决于分子的大小及极性基团的极性大小和多少。一般来说，两种基本母核相同的成分，分子中的功能基的极性越大，数量越多，则极性越大，亲水性越强，而亲脂性就弱；反之，则亲脂性越强，亲水性就弱。极性小的成分在亲脂性溶剂中溶解度大，而极性大者在亲水性溶剂中溶解度大，这就是所谓“相似相溶”的经验规律。这常作为从天然药物中提取有效成分选择溶剂时的主要依据。

（2）溶剂的种类　溶剂提取法的关键是选择适宜的溶剂，可根据“相似相溶”的原则进行选择，并从以下三方面加以考虑：a.溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；b.溶剂不能与天然药物的成分发生化学反应；c.溶剂要价廉、易得、使用安全。

常见的溶剂可分为以下三类：

①水：水是一种价廉、易得、使用安全、穿透性极强的强极性溶剂。天然药物中的亲水性成分都可溶于水中，如糖类、鞣质、无机盐、有机酸盐、氨基酸、蛋白质、生物碱盐及多数苷类成分等。有时还用酸水或碱水作溶剂，用碱水增大酸性成分在水中的溶解度，用酸水增大碱性成分在水中的溶解度。当药材用水加热煎煮时，由于加热可提高一些成分的溶解度，同时由于中药中一些成分的助溶作用，亲脂性成分也可被部分提出。用水提取的缺点是，可能会使某些苷类成分酶解，水提取液易发霉、变质，热水煎煮后含淀粉、果胶、黏液质多的中药水提液多较黏稠，过滤困难，并且水溶性杂质多，如糖、蛋白质等。此外水的用量大，增加了浓缩、蒸发、分离精制时的困难。

②亲水性有机溶剂：这是一类极性较大能与水混溶的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，以乙醇最常用。此类溶剂对植物细胞穿透能力较强，溶解范围广泛，具有提取液黏度小、沸点低、不易霉变等优点。如乙醇，可以通过调节其浓度，既用于提取极性成分，也用于提取某些亲脂性成分，在提取分离中应用十分广泛。但是，易燃、价格较高是此类溶剂的缺点。

③亲脂性有机溶剂：这是一类与水不能混溶的有机溶剂，如乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯、石油醚等。可用来提取脂溶性成分，如游离生物碱、苷元、挥发油、油脂、叶绿素、树脂等。亲脂性溶剂一般挥发性大，易燃，价格较贵，提取时对设备要求较高。这类溶剂对药材组织的穿透能力较弱，提取时间较长，一般亲脂性有机溶剂不宜用于中成药生产。

（3）溶剂提取法操作方法　提取方法可根据所用溶剂的特性及欲提取成分的性质来选择。

①冷浸法：此法是将药材粗粉装入适当的容器中，加入一定量的溶剂（一般用酒或稀醇），浸泡药材以溶出其中成分的方法。此法操作简便，适宜含树胶、淀粉等成分较多的药材以及含挥发性成分、遇热不稳定易分解或破坏的成分的提取。但此法提取时间长、溶剂用量大，提取效率不高。

②渗漉法：此法是将药材粉末用适当的溶剂润湿膨胀后，装入渗漉筒中，不断添加新溶剂，使其渗透到药材粉末中，溶解可溶性成分并随溶剂自上而下从渗漉筒下口流出的一种提取方法。渗漉法所用溶剂多为不同浓度的乙醇，在室温下进行，适用于遇热易破坏的成分的提取。本法在渗漉过程中，不断加入新溶剂，保持良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故提取效率较高，但提取时间较长。

③煎煮法：此法是将药材加水加热煮沸，而使有效成分溶解出来的一种提取方法。将药材饮片置于适当容器中（忌用铁器）加水浸过药面，充分浸泡润湿后，加热煮沸1～3次，每次1～2h，要注意不断搅拌，避免容器底部焦煳。本法简便易行，提取效率比冷浸法高，可以溶出大部分有效成分，但提取液中水溶性杂质相对也多。对含挥发性成分及遇热不稳定的成分的药材不宜用本法。对含有多糖类的药材，煎煮后药液黏稠，过滤较困难。水煎液易霉变、腐败，不易存放。

④回流提取法：此法是当用有机溶剂又需加热提取时，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失的一种加热提取法。少量提取时，可将药材粗粉置于大小适宜的烧瓶中，再加溶剂使其浸过药面1～2mL，搭建回流装置，加热回流1～2h，滤出提取液；加入新溶剂重新回流，如此反复几次。大量生产可采用类似的装置。此法提取效率较冷提法高，但受热易破坏的成分不宜用此法。

⑤连续回流提取法：此法是采用连续回流装置进行提取的方法。在实验室常用索氏提取器，在连续回流提取过程中，药材不断接触新溶剂，能始终保持较高的浓度差，所以提取效率高，溶剂用量小。但提取时间较长，常需数小时至几十小时，溶出成分在烧瓶内长时间受热，遇热不稳定易分解的成分不宜用此法。

⑥超声提取法：样品置适宜容器内，加入提取溶剂后，置超声波振荡器中进行提取。本法提取效率高，经实验证明一般样品30min内即可完成。

⑦超临界流体萃取法（SFE）：常用二氧化碳超临界流体萃取。主要适于较低极性化合物的提取。对极性较大的化合物，近年来通过加夹带剂的方法也可提取。

2.水蒸气蒸馏法

本法是将水蒸气通入含有挥发性成分的药材中，使药材中挥发性成分随水蒸气蒸馏出来的一种提取方法。适用于能随水蒸气蒸馏而与水不相混溶的成分的提取。挥发油的提取常用此法。此外，其他的一些挥发性成分也可用此法提取，如麻黄碱、烟碱、槟榔碱等。

水蒸气蒸馏法是根据分压定律，当挥发性成分与水共同加热时，整个系统的蒸气压应为各组分蒸气压之和。即

式中，P为总蒸气压；为水蒸气压；PA为与水不混溶的挥发性液体的蒸气压。

当液体总蒸气压与大气压相等时，液体开始沸腾。因此两组分化合物混合蒸馏时，混合液的沸点低于任何一组分的沸点，挥发性成分可在比其沸点低的温度下被蒸馏出来。馏出的挥发油在水中的溶解度小，则可与水分层，而将其分出；若在水中的溶解度大，可用盐析法使挥发性成分在水中析出，或用低沸点有机溶剂萃取，回收有机溶剂即得到挥发性成分。

3.升华法

固体物质受热不经液态直接气化，遇冷后又凝固为固体，称之为升华。天然药物的某些成分具有升华的性质，故可利用升华的方法直接自天然药物中提取出来。如茶叶中的咖啡因、大黄中游离羟基蒽醌类成分、牡丹皮中的丹皮酚。

（二）待测试样品的精制

中药或中药制剂经提取后，得到的常是含有较多杂质的混合物，需要经过净化分离后才能进行分析测定。净化分离方法设计主要依据待测成分和杂质理化性质的差异。还要结合所要采用的检测方法进行选择。常用的净化分离方法有以下几种。

1.系统溶剂分离法

此法是将提取浓缩后的总提取物用3～5种极性由低到高的不同溶剂依次进行溶解，使总提取物中性质不同的成分依次溶解在不同的溶剂中，而使各成分得以分离的一种方法。

此种操作方法比较烦琐，同一成分可能溶解在不同的溶剂中，给下一步的处理带来困难，以致影响到药理试验的准确性。尽管如此，系统溶剂分离法仍是研究成分不明的天然药物常用的一种方法。

2.两相溶剂萃取法

两相溶剂萃取法简称萃取法，是在提取液中加入一种与其不相混溶的溶剂，通过振摇使原提取液中的某些成分转溶到加入的溶剂中，而其他成分仍留在原提取液中。如此反复多次，将所需成分萃取出来的分离方法。

萃取法主要理论依据为分配定律，利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而达到分离的目的。分配系数是指在一定温度时，一种物质溶解在相互接触但又不能混溶的两相溶剂中，溶解平衡后，两溶剂中溶质浓度的比值。溶质在两相溶剂中的分配比（K）在一定温度及压力下为一常数：

式中，K为分配系数；CA为物质在上层溶剂中的浓度；CB为物质在下层溶剂中的浓度。

各种成分分离难易可以用分离因子β表示，分离因子β可定义为A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。一般情况下，当β≥100时，仅做一次简单萃取就可实现基本分离；当100>β≥10时，则需萃取10～12次；β≤2时，要实现基本分离，需做100次以上萃取才能完成。β≌1时，则KA≌KB，意味着两者性质极其相似，即使做任意次萃取也无法实现分离。

因此，实际工作中，尽量选择分离因子β值大的溶剂系统，以求简化分离过程，提高分离效率。即混合物中各成分的分配系数相差越大，分离效果越好。

天然药物成分很少有现成的分配系数作为参考，所以在实际工作中对溶剂的选择，常根据被分离成分在两相溶剂中的溶解度来决定。如水提取液中的有效成分是偏亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如乙醚、苯、三氯甲烷进行萃取；如果有效成分是偏于亲水性的物质，就选用弱亲脂性的溶剂，如乙酸乙酯、丁醇、正丁醇等溶剂萃取，也可采用三氯甲烷或乙醚中加入适量乙醇或甲醇的混合溶剂，以增大萃取溶剂的亲水性。例如分离亲水性强的皂苷时，多选用正丁醇或异戊醇与水进行萃取；分离黄酮类成分时，则往往采用乙酸乙酯和水进行萃取。但要注意的是：有机溶剂亲水性越大，与水做两相萃取的效果就越差，因为能使较多的亲水性杂质伴随而出，对有效成分进一步精制影响很大。

此外，对酸性、碱性及两性化合物来说，分配比还受溶剂系统pH值的影响。因为pH值的变化可以改变它们的存在状态（游离型或解离型），从而影响在溶剂系统中的分配比。如酚类和羧酸类化合物一般在pH<3的情况下，酸性物质多呈非解离状态（HA）、碱性物质则呈解离状态（BH+）存在；但pH>12，则酸性物质多呈解离状态（A—）、碱性物质则呈非解离状态（B）存在。据此，可采用在不同pH值的缓冲溶液与有机溶剂中进行分配的方法，使酸性、碱性、中性及两性物质得以分离。

分次萃取操作中应注意几点：a.避免乳化现象出现；b.提取液的浓度适当，过稀萃取溶剂用量大，过浓则两相不易充分接触；c.萃取溶剂与提取液应保持适当的比例。

3.沉淀法

在天然药物提取液中加入某些试剂使某些成分产生沉淀，与不能产生沉淀的成分得到分离的方法。多用于提取液中各成分溶解度性质相近，不宜用萃取法，以及亲水性成分的分离。常用的沉淀法有下面几种。

（1）乙醇沉淀法　利用水提取液中的某些成分（如淀粉、树胶、黏液质、蛋白质等）在乙醇达到一定浓度时析出沉淀而达到分离的一种操作方法。

（2）铅盐沉淀法　利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的铅盐沉淀，从而使各成分得以分离的方法。中性醋酸铅可使有机酸、氨基酸、蛋白质、黏液质、鞣质、酸性皂苷、树脂及部分黄酮类等成分产生沉淀；碱式醋酸铅沉淀范围更广，除上述成分外，还可沉淀某些中性或碱性成分，如中性皂苷、异黄酮苷、糖类、生物碱等。通常将天然药物的水或醇提取液先加入醋酸铅溶液至不再沉淀为止，静置后滤出沉淀；再向滤液中再加碱式醋酸铅饱和溶液至不再发生沉淀为止。这样就得到醋酸铅沉淀物、碱式醋酸铅沉淀物及母液三部分，然后将铅盐沉淀悬浮于水、醇或丙酮中，通入硫化氢脱铅，天然药物成分留在溶液中。

（3）酸碱沉淀法　这是利用某些成分在碱（或酸）中溶解、在酸（或碱）中沉淀的性质达到分离的方法。如：不溶于水的酸性成分或含有内酯环的成分均可溶于碱液，加酸使酸化后又析出沉淀。同样，不溶于水的碱性成分易溶于酸液中，加碱又沉淀析出。此法在生物碱、黄酮、蒽醌类成分分离中常用到。

（4）试剂沉淀法　利用某些成分在某种试剂的作用下产生沉淀而使某些成分得以分离的方法。如在生物碱盐的溶液中，加入生物碱的沉淀试剂（苦味酸、磷钨酸等），使生物碱生成不溶性复盐而析出沉淀；在分离水溶性生物碱时，可在水液中加入雷氏铵盐使其生成生物碱雷氏盐沉淀析出。

4.盐析法

在天然药物的水提取液中加入无机盐，如氯化钠、硫酸镁、硫酸钠、硫酸铵等，达到饱和或接近饱和状态，使某些成分在水中的溶解度降低而析出沉淀分离。如自三颗针中提取小檗碱在生产上都采用氯化钠进行盐析。

5.结晶法

利用混合物中各成分在溶剂中的溶解度不同达而到分离的一种方法。是分离精制常用的方法之一。具体的操作是：选择合适的溶剂，将经过提取分离后只含几种成分的混合物溶解，使成为饱和溶液，溶液低温放置或蒸发除去部分溶剂后再低温放置，使有效成分析出结晶而与溶液中的杂质分离，这个过程称为结晶。一次结晶会带一些杂质，常需通过反复结晶处理（重结晶），最后得到纯的结晶。

结晶的关键是溶剂的选择：a.对欲结晶的成分冷热溶解度差别要大，而对杂质冷热均不溶或冷热均易溶；b.不与欲提纯的成分发生化学反应；c.溶剂的沸点不宜过高或过低。过高时，附着于晶体表面的溶剂不易除去；过低时则溶解度冷热时变化不大，不利于析晶。

6.透析法

利用小分子物质在溶液中可通过半透膜、大分子物质不能通过半透膜的性质进行分离的方法。例如分离和纯化蛋白质、皂苷、多肽、多糖等物质时，可用透析法除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而使小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制。

7.分馏法

利用各成分沸点不同，在分馏柱（塔）中通过控制分馏的温度，分别收集不同温度下馏出液使各成分得以分离的方法。此法在有机合成或混合溶剂的回收中应用十分广泛，在天然药物化学中也用于挥发油及一些液体生物碱的分离。蒸气进入分馏柱时，由于柱外空气的冷却，部分蒸气凝成液体，上行的蒸气碰到下行的冷凝液，就产生热交换，如上行的蒸气包含着几种成分，显然高沸点的成分较易被冷凝，随着分馏柱管的升高，愈向上，混合蒸气中所含高沸点的成分愈少，到了一定高度时，可获得纯的某一成分。为了增加热交换的机会，在柱中装有填充料（如短玻璃管、玻璃珠等），填充料间应有空隙，使冷凝液与蒸气通畅对流，扩大接触面，提高分馏效果。

8.色谱法

色谱法是中药成分分析中最常用的分离精制方法，最大的优点在于分离效能高，快速简便。通过选用不同的分离原理（如吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、大孔吸附树脂等）、不同的操作方式（如柱色谱、薄层色谱等）和不同的色谱材料，达到对各种成分的分离精制。

三、定性鉴别、检查和含量测定

（一）定性鉴别

1.显微鉴别

显微定性鉴别包括显微组织学鉴别和显微化学鉴别。

（1）显微组织学鉴别　是指用显微镜对药材的切片、粉末、解离组织、表面制片或中成药的组织、细胞、内含物等特征进行特征性鉴别的一种方法。鉴别时要选择具有代表性的样品，根据各不同药材鉴别要求分别制片。而中成药则应根据不同剂型要求适当处理后制片，再进行显微观察鉴别。显微鉴别不仅在单味药材的鉴别时应用较多，在中成药中的应用也十分广泛。2005年版《药典》中就有不少中药材和中成药的鉴别都是采用粉末显微鉴别的方法。

（2）显微化学鉴别　利用某些中药中的某些成分在化学反应后的显微特征来进行定性鉴别。例如在组织切片或粉末药材鉴别中滴加适当的沉淀试剂、显色试剂，用显微镜观察所形成的反应物形态、颜色等特征；如果药材中具有挥发性成分，可用升华法制得升华物，用显微镜直接观察或滴加试剂后再行观察。

2.理化定性鉴别

理化定性鉴别是利用中药中所含有的物质的理化性质进行定性鉴别。可测定其理化常数和观察理化性质，也可选择适当的化学反应来检验。如中药中有皂苷类成分，既可用皂苷的显色反应，也可用泡沫试验或溶血试验来鉴定；如含有香豆素类成分，可用颜色反应或荧光反应进行定性分析等。

3.色谱定性鉴别

色谱定性鉴别中应用最多的是薄层色谱定性。由于薄层色谱具有分离和鉴定的双重功能，只要一些特征斑点（甚至是未知成分）具重现性，就可以作为定性依据。对照品可选择化学标准品、有效部位（如总生物碱、总皂苷等）或标准药材，并可选用薄层标准图谱定性。薄层色谱法可鉴别真伪，区别多来源或相似品种，控制成分或有毒成分的限度。各国药典均将薄层色谱定性作为鉴别天然药物的最主要方法。另外纸色谱、高效液相色谱、气相色谱在定性分析也有比较广泛的应用。

（二）检查

1.一般理化项目检查

包括浸出物及总固体测定、相对密度测定、旋光度测定、折射率测定、水分测定、干燥失重测定、乙醇含量测定等。

2.杂质检查

包括杂质限量检查、灰分测定、酸碱度检查、氯化物检查、特殊杂质与掺伪物检查等。

3.重金属检查

包括铅盐、砷盐、铁盐的测定及其他重金属测定。

（三）含量测定

含量测定是保证中药质量的最重要方法。进行测定时，一般是测定药材中的有效成分和有效部位的含量。但由于中药所含成分复杂，加之有时有效成分和有效部位不是很清楚，因此在实际分析工作中要根据实际情况，选择较为适当或具特征性的成分进行分析。主要有以下几种方法。

1.有效成分含量测定

对于有效成分明确的中药及中成药，应进行有效成分的含量测定。

2.有效部位含量测定

某些中药及中成药，大致明确主要活性物质是哪一类成分，就可以进行其有效部位的测定，如总生物碱、总皂苷、总黄酮等，测定的是有效部位的总含量。

3.有效成分不明确的中药及中成药测定

（1）可选择一个或几个认为可能的有效成分或主要成分进行测定。

（2）测定药物的总固体量，如水浸出物量、醇浸出物量、乙醚浸出物量，以间接控制质量。

（3）对在加工炮制、制备、贮藏过程中易损失、破坏的成分进行含量或限量检查。

（4）可选用适当的生物效价或其他生物化学方法控制质量。

4.贵重药材或含剧毒成分的中药测定

尽可能测定其中的有效成分或剧毒性成分的含量。

含量测定方法主要根据待测成分的性质，并参考有关资料进行选择。目前在中药分析中应用最多的是色谱法和光谱法；其他方法，如电化学方法、化学分析法、生物化学方法等也有应用。值得一提的是目前分析技术和计算机技术的联用在中药及中成药分析中的应用十分广泛。

（王甫成）