第二节　色谱法

一、薄层色谱法

薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC）系将供试品溶液与对照物溶液点于同一薄层板上，在展开容器内用相应的展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定的方法。

（一）概述

自20世纪60年代薄层色谱技术作为一种快速、简单、灵敏的鉴别手段应用于中药、饮片及中成药的鉴别，《中华人民共和国药典》（2005年版）一部将薄层色谱法用于鉴别已达1523项，用于含量测定为45项。薄层扫描用于许多中药及中成药的含量测定，在控制中药质量方面起到积极的作用，中药生产及质量监督管理部门已广泛使用。

薄层色谱独有的特点是分析结果以直观的彩色图像表达，为其他色谱技术所不能。而图像给出的多层面的信息是文字难以表达的，而且丰富多彩的图像可以给分析者更多的思考判断的空间。

薄层色谱法各单元操作既有关联，又相互独立，点样器材和方法、展开方式、显色试剂选择、直观比较或扫描比较可根据需要灵活变通。根据需要操作可以视实际需要和实验室条件分层次进行和中止，节省分析时间和资源，因此具有离线操作的灵活性、个人占机时间短的特点。

（二）仪器与材料

1.薄层板

常用薄层板有硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜等。市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板。如需对薄层板进行特别处理和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制的薄层板。

2.点样器

一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。

3.展开容器

上行展开用平底或双槽展开缸；水平展开用水平展开缸；也可用全自动控湿展开仪、薄层色谱全自动多极展开系统（瑞士卡玛）等。

4.显色装置

喷雾显色采用玻璃喷雾瓶；浸渍显色采用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色采用双槽展开缸等。

5.检视装置

包括装有可见光、254nm及365nm紫外光光源三用紫外分析仪，暗箱式紫外观察仪，薄层色谱摄影仪等。

6.薄层色谱扫描仪与薄层数码成像

薄层色谱扫描仪的工作原理有两类：狭缝扫描光密度检测和CCD数码成像分析。

狭缝扫描（可变波长扫描）是经典的方法，是指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于鉴别、检查或含量测定。

薄层数码成像分析技术是利用数码成像设备获得薄层板上各点的光强度信息，之后对获得图像进行分析的薄层分析技术，被称为“第二代薄层色谱扫描仪”。由于数码扫描仪采用逐行成像技术，为便于区分传统薄层扫描仪的逐点扫描，将数码扫描仪称为逐行扫描仪。数码成像设备包括两种：照相机和扫描仪。

狭缝扫描光密度检测的优势在于可选择特定波长，因此可以找到检测物质的最大吸收峰，从而提高检测的精度。而数码成像分析的优势在于仪器投资成本低，操作方便，更易被分析人员接受。

（三）操作步骤与要求

1.操作步骤

样品处理→点样→展开→显色与检视→成像→含量测定

2.操作要求

（1）薄层板活化　临用前薄层板一般应在110℃活化30min（聚酰胺薄膜不需活化）。置干燥器中备用。

（2）点样　于薄层板上点样，可选用圆点状或窄细的条带状。圆点状直径一般不大于3mm（高效板一般不大于2mm）；条带状宽度一般为5～10mm（高效板条带宽度一般为4～8mm）。点样基线距底边10～15mm（高效板一般基线离底边8～10mm），点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm（高效板供试品间隔不少于5mm）。接触点样时注意勿损伤薄层表面。最好选用半自动或自动点样器械以喷雾法点样。

（3）展开　将点好样品的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜（切勿将样点浸入展开剂中），密闭。一般上行展开8～15cm（高效薄层板上行展开5～8cm）。溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测。

展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭，一般保持15～30min。溶剂蒸气预平衡后，迅速放入载有样品的薄层板，立即密闭，展开。如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则须在展开缸的内侧放置与展开缸内径同样大小的滤纸，密闭一定时间，使达到饱和再展开。必要时，可进行二次展开或双向展开。

（4）显色与检视　薄层板展开后直接在日光下检视，或用喷雾法、浸渍法显色后，在日光下检视。有荧光的物质可在365nm紫外光灯下观察荧光色谱。某些试剂可激发荧光。

对于可见光下无色，但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂的硅胶板（如硅胶GF254板），在254nm紫外光灯下观察荧光板面上的荧光猝灭物质形成的色谱。

（5）成像　薄层色谱一个很大的优势是色谱结果可视并且可以用图像形式保存，可以方便地在同一块薄层板上对多个样品进行质量评估。早期对TLC板目视观测后需要采用文字来表述，还常常采用画草图的方式记录斑点；后来逐渐采用成像方式将薄层板的结果永久保存；现在则可以采用视频或数码相机捕捉电子图像，这是记录TLC板最有效并能重现的方式。也有人采用台式扫描仪记录有颜色的斑点。如果采用合适的软件，电子图像可以用符合GXP规范的方式进行标注、保存、转换并打印。

成像的基本要求是无论是否需要衍生化，色谱需“可见”。现代成像系统有三种光源可选，分别是254nm紫外光、366nm紫外光以及白色可见光。在含有荧光指示剂的薄层板上，指示剂在短波长（254nm）紫外光激发下产生绿色或蓝色的光，对UV254有吸收的样品在薄层板上显暗色。长波长（366nm）紫外光用以激发物质产生荧光。必须加载滤光片阻止紫外光灯产生的光进入相机，只让产生/激发的不同波长（可见）的荧光通过。可见光成像用于有颜色的物质，可以采用三种照明模式：反射、透射、反射+透射。反射产生的图像类似于可见光下裸视观测薄层板的效果，附加透射可以对较弱的斑点产生更多细节，因为薄层深层的样品分子也会对图像的形成产生帮助。

采用电子图像对薄层板与薄层板之间进行准确比较，必须保证拍摄时照相机所有的参数一致，包括白平衡、光圈、曝光时间、焦距和放大等。采用数码相机设置，控制所有功能可以达到这一要求。根据GXP规范，成像过程的所有参数必须可溯源并随图像一起保存（如CAMAGDigi Store2数码成像系统）。

（6）含量测定　按照薄层色谱扫描法，测定供试品中相应成分的含量。

薄层色谱扫描法系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于鉴别、检查或含量测定。测定时可根据不同薄层扫描仪的结构特点，按照规定方式扫描测定，一般选择反射方式，采用吸收法或荧光法。含量测定应使用市售薄层板。

扫描方法可采用单波长扫描或双波长扫描。如采用双波长扫描，应选用待测斑点无吸收或最小吸收的波长为参比波长，供试品色谱中待测斑点的比移值（Rf值）和光谱扫描得到的吸收光谱图或测得的光谱最大吸收与最小吸收应与对照品相符，以保证测定结果的准确性。薄层扫描定量测定应保证供试品斑点的量在线性范围内，必要时可适当调整供试品溶液的点样量，供试品与对照品同板点样、展开、扫描、测定计算。

薄层色谱扫描用于含量测定时，通常采用线性回归二点法计算，如线性范围很窄时，可用多点法校正多项式回归计算。供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上，供试品点样不得少于2个，对照品每一浓度不得少于2个。扫描时，应沿展开方向扫描，不可横向扫描。

附1　薄层板要求与分离度

（1）自制薄层板　玻璃板用5cm×20cm、10cm×20cm或20cm×20cm的规格，要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。将1份固定相和3份水（或加有黏合剂的水溶液）在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2～0.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃烘30min，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检视，表面应均匀、平整、光滑，无麻点、无气泡、无破损及污染。

（2）薄层板预洗　薄层板在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂（8:2）在展开缸中上行展开预洗，110℃活化，置干燥器中备用。

（3）分离度　用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点，应显示两个清晰分离的斑点。用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度（R）的计算公式为：

R=2（d2-d1）/（W1+W2）

式中，d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离；d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离；W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。

除另有规定外，分离度应大于1.0。

附2　CAMAG-Ⅲ型薄层扫描仪（TLC SCANNER 3）操作规程

1.仪器的组成及开机

（1）仪器的组成　CAMAGTLCSCANNER3是由扫描仪主机、计算机系统、打印机、绘图仪组成。通过标准接口相互连接，且分别有各自的开关，它是进行薄层色谱定性或定量用的专用仪器。

（2）开机

①接通电源；

②打开不间断电源；

③待不间断电源的“Normal”指示灯亮后，打开CAMAG-Ⅲ型扫描仪主机开关，再分别打开打印机、绘图仪、计算机显示器的开关，最后打开计算机的开关。

2.扫描

当计算机进入Windows操作系统后，用鼠标点击计算机桌面上的薄层扫描软件Win-CATS的图标，进入Win CATS的工作界面，进行以下操作。

①选择“File”菜单内“New”一项；选择“Create”一项中“Method”，输入方法名按确认，建立一个新方法；

②点击左面的窗格中的“Method”，在右面的窗格中和前面打上钩。

③点击左窗格中的“Stationary Phase”，在右窗格的“Size”一项选择薄层板尺寸大小；

④点击左窗格中“Definitions-Quantitative”，然后点击右窗格中下面的“Quantitative General”项，然后在这个对话框中的“Sample Definitions”项内“Numberof Samples”输入待测样品数，在“Substance Def-initions”框内“Numberof Substances”输入组分数目；在“Evaluation Definitions”框内“Calibration Mode”选择计算方法（单点法选“Single Level”，多点法选“Multi Level”），并在“Numberof Standard”中输入标准品数目。

⑤点击右面窗格的下面的“Samples”，在这个对话框中的“Sample Id”输入待测样品名称；点击右面窗格下面的“Substances”，然后在“Substance Name”中输入组分名称。

点击右窗格中下面的“Substances”，在这个对话框中输入各个组分的不同的水平的量。

⑥在左面窗格中点击“Detection-Scanner3”，点击右面窗格中下面的“Sc3General”，在这个对话框中设置扫描模式（“Single wavelength”为单波长；“Multiple wavelengths”为多波长；“Background correction”为双波长）。

⑦点击右面窗格中下面“Sequence”，输入“Numberoftrack”（轨道数），“Distancebetween”（轨道间距），“Positionoffirst Y”（第一轨道距左边的距离），“Scanstartposition Y.”（扫描起始Y），“Scanendposition Y”（扫描结束Y）。

将薄层板放入CAMAG-Ⅲ型扫描仪中，按扫描仪面板上的“Illum”键，打开扫描仪内的指示光标，调整扫描道的坐标，以检查所输入的扫描坐标参数是否正确，输入各参数。

⑧点击“Scan-1WL”，进入扫描光参数设置对话框，设置狭缝，波长，选择灯参数，测量模式。

⑨点击左面的窗格中的“Evaluation Quantitative”，然后在右面的窗格中区分开每个轨道的Type（选择Stardard1，Stardard2，…，Sample）

⑩点击Win CATS软件工具栏中的，并输入数据保存文件名。

点击Win CATS软件工具栏中的，开始扫描。

3.积分

①选积分范围：在左边窗格点击以波长显示的数据菜单项，点击选取其中一轨道。

点击选取“Baseline display”后，拖动积分起始和结束位置虚线，选取积分区域。

②峰处理：点击选取“Peak display”，然后右键点击选择峰处理的三个模式“Normal display mode”、“Manual baseline correction mode”和“Manual peak definition mode”，进行峰处理。

4.计算

①双击左窗格中的“Evaluation-Quantitative”项，在右面的窗格中点击“Substanceassignment”进入指定组分对话框。拖动组分名上下虚线包括所示选取定义的峰，或直接点击峰点使其连入红线，或点击。

②双击“Calibration”后出现组分名，点击组分名显示计算结果，“Substancesummary”显示组分计算结果表，“Graphheight”显示组分高度计算结果显示图，“Graph Area”显示组分面积计算结果显示图。

5.打印报告

点击“File”菜单，选取“Reportsetup”项，打印报告。

6.关机

实验完毕，取出薄层板，关闭Win CATS软件，先关计算机主机开关，再关显示器、打印机或绘图仪、扫描仪的开关，检查并关闭电源。

（时维静）

二、高效液相色谱法

高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）是在液相色谱法的基础上发展起来的分离分析技术，具有高压、分离效能高、灵敏度高及分析速度快等特点。目前，此方法已被广泛应用于化学、医学、工业、农业、环保等领域。

（一）工作原理

HPLC的基本原理是利用分析样品中各组分在流动相和固定相之间分配系数不同，当分析样品随流动相进入色谱柱后，样品中各组分在流动相和固定相之间进行反复多次的分配，由于固定相对各组分的吸附能力不同，各组分在色谱柱中移动的速度不同，经过一定的柱长后，各组分就以前后不同的顺序流出色谱柱，进入检测器，通过检测器检测并转变成电信号，输入记录器将检测器输出的信号以色谱峰的形式记录下来。

（二）高效液相色谱仪的组成

HPLC系统一般由泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中泵、色谱柱、检测器是HPLC系统的关键部件。现在有的高端仪器还配有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温箱等。半制备型HPLC仪还配备有自动馏分收集装置。

1.泵

（1）泵的构造和性能　泵是HPLC系统中最重要的部件之一，其性能好坏直接影响到系统的质量和分析结果的可靠性。泵一般应具备以下性能：a.流量稳定，其RSD<0.5％，这对定性定量的准确性至关重要；b.流量范围宽，分析型应在0.1～10mL/min范围内连续可调，制备型应能达到100mL/min；c.输出压力高，一般应能达到150～300kg/cm2；d.液缸容积小；e.密封性能好，耐腐蚀。按输液性质不同，泵又可分为恒压泵和恒流泵。

（2）使用和维护注意事项　为了延长泵的使用寿命和维持输液的稳定性，操作时应注意以下几点。

①防止尘埃或其他杂质微粒等进入泵体，否则会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀。因此，流动相在使用前最好用0.22μm（或0.45μm）孔径的滤膜过滤，以除去流动相中的固体微粒。泵的入口要连接滤头（或滤片）。

②流动相不应含有腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不能保留在泵内，以免盐结晶析出损坏密封环或堵塞柱头。

③泵工作时要防止溶剂瓶内的流动相被吸干，否则空泵运转会磨损柱塞、缸体或密封环，从而导致漏液。

④输液泵的工作压力不能超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，导致漏液。

⑤流动相使用前要先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定。

2.进样器

现在大多使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求：密封性能好，死体积小，重复性好，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。

（1）六通进样阀　以美国Rheodyne公司的7725型和7725i型最常见，其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效相对较低，但耐高压（35～40MPa），进样量准确，重复性好，操作方便。

（2）自动进样器　主要用于数量较多样品的常规分析。

3.色谱柱

色谱柱是液相色谱的核心部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。目前，色谱柱的填料主要有多孔硅胶、以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）及多孔炭等，其粒度一般有3μm、5μm、7μm、10μm等。由于硅胶具有线性容量较高、机械性能好、不溶胀、与大多数试样不发生化学反应等优点，因此，硅胶填料用得最多。

（1）柱的构造　色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，管内壁要有较高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，由烧结不锈钢或钛合金制成，目的是防止填料漏出。

色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同：常规分析柱（常量柱），内径2～5mm（常用4.6mm），柱长10～30cm，常用的为15cm、25cm；实验室制备柱，内径20～40mm，柱长10～30cm。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。另外，还有生产型制备柱。

（2）使用和维护注意事项　色谱柱的正确使用和维护十分重要，否则会导致柱效降低，使用寿命缩短，甚至损坏色谱柱。色谱柱在使用过程中，要注意以下问题。

①避免压力和温度的急剧变化及任何机械振动。温度的突然变化或强烈的机械振动会影响柱内的填充状况；柱压的骤升骤降也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应缓慢进行。

②应逐渐改变流动相中有机相与水相的比例，特别是反相色谱柱，流动相不能直接从100％的有机相改为100％的水相，反之亦然。

③不能反冲色谱柱，只有生产厂家标明可以反冲时，才可以反冲除去残留在柱头的杂质，否则会使柱效急剧降低。

④流动相pH值要适宜，以避免固定相被破坏，流动相的pH值要严格控制在说明书规定的范围内。

⑤含杂质较多的样品尤其是生物样品需进行前处理后方可进样测定，在色谱柱前端连接一保护柱可以延长色谱柱的使用寿命。

⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱，可以有效清除残留在柱内的杂质。

⑦保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，拧紧柱接头，防止溶剂挥发导致填料干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或放置更长时间。

⑧色谱柱在使用过程中，如果压力突然升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子堵塞柱头；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能是柱头塌陷，死体积增大所致。

⑨装在HPLC仪上的柱子如不经常使用，应每隔4～5天开机冲洗15min。

4.检测器

检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中各组分的量转变为电信号。检测器要具有灵敏度高、噪声低、线性范围宽、重复性好和适用范围广等特点。HPLC法常用的检测器有紫外检测器（包括二极管阵列检测器）、荧光检测器、示差折光检测器、电导检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器等。

（1）紫外检测器　紫外检测器是HPLC中应用最广泛的检测器，具有灵敏度高、噪声低、线性范围宽、对流速和温度不敏感、可用于梯度洗脱等特点。其原理是根据被测组分对特定波长紫外光的选择性吸收。适用于具有紫外吸收或经衍生化后具有紫外吸收的组分，可用于测定生物样品中大多数药物和内源性成分。二极管阵列检测器被称为21世纪标准紫外检测器，其主要优点是能够采集三维谱图，可进行峰纯度检验，可进行光谱库检索，可以发现单波长检测时未检测到的峰。

（2）荧光检测器　荧光检测器的优点是灵敏度高，是最灵敏的检测器之一；选择性好；对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱。其原理是根据被测组分发射的荧光强度进行检测。适用于测定具有天然荧光或通过衍生化能转变成荧光衍生物的物质。由于可选择最大激发波长和最大发射波长来检测药物，通常荧光检测器的灵敏度比紫外检测器高几个数量级。缺点是荧光衍生化试剂的种类有限，衍生化反应又使样品预处理过程复杂化；同时，试剂中的荧光杂质会对测定的重现性和灵敏度产生干扰。

（3）示差折光检测器　示差折光检测器是通用型检测器。但该检测器对温度变化敏感；对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测；属于中等灵敏度的检测器。其原理是连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。

（4）电导检测器　优点是对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱。缺点是对温度变化敏感（温度每升高1℃，电导率增加2％～2.5％）。主要用于检测无机离子和有机离子。其原理是根据物质在某些介质中电离后所产生的电导率的变化来测定电离物质的含量，广泛应用于离子色谱法。

（5）蒸发光散射检测器　优点是消除了溶剂干扰及温度变化带来的基线漂移，可梯度洗脱，灵敏度高，是HPLC的通用型检测器；缺点是不能使用不挥发性盐作流动相，如磷酸盐等。其原理是流出物在检测器中被高速氮气喷成雾状液滴，溶剂挥发后，溶质形成微小颗粒，被载气带到检测系统，进入散射室中，检验散射光的强度。

（6）电化学检测器　电化学检测器的灵敏度比紫外检测器和荧光检测器灵敏度更高，一般可至ng级～pg级水平，凡含有硝基、羰基、氨基酸等电化学活性基团的药物都能产生电解电流而被测定。

5.数据处理和记录装置

早期的HPLC仪是用记录仪记录检测信号，再手工测量计算。20世纪80年代后，计算机技术的广泛应用使HPLC操作更加快速、简便、准确、精密和自动化。现在采用的计算机控制的主要功能有：采集、处理和分析数据，控制仪器，色谱系统优化和专家系统等。

（三）分类

按分离机制的不同，高效液相色谱法可分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及尺寸排阻色谱法等。

1.液固吸附色谱法

液固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是多孔的固体颗粒物质。其原理是根据固定相对被分离组分吸附作用的不同进行分离。大多用于非离子型化合物的分离。

2.液液分配色谱法

液液分配色谱法中流动相和固定相都是液体，无论是极性或非极性的，水溶性或油溶性的，离子型或非离子型化合物均适于采用此种方法分离。其原理是根据被分离组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。液液分配色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法和反相色谱法两种（表2-1）。

（1）正相色谱法　以极性的有机基团，如CN、NH2双羟基等键合在硅胶表面作为固定相；而以非极性或极性较小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如三氯甲烷、醇、乙腈等）为流动相。适用于分离中等极性和极性较强的化合物，如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等。

（2）反相色谱法　采用极性较小的键合固定相，如C18、C8等；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性或极性较弱的化合物。反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛。当前，随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围也逐步扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。

3.离子交换色谱法

此法是用离子交换原理与液相色谱技术相结合来测定溶液中阳离子或阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子，应用范围较广。

4.离子对色谱法

离子对色谱法又称偶离子色谱法，它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱性物质。

分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成强的离子对；分析酸性物质常用的离子对试剂为四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐等。

5.尺寸排阻色谱法

尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。其原理是利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而进行分离。其固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。分子量小的化合物可以进入孔中，滞留时间长；分子量大的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。常用于分离高分子化合物，如提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

（四）HPLC的流动相

在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现被测组分理想的分离，是色谱工作者的重要工作。

1.流动相的性质要求

理想的流动相溶剂应具有黏度低、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特点。通常情况下，选择流动相溶剂应注意以下几点。

①HPLC级溶剂。

②不会引起柱效损失或保留特性变化。如碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等作吸附剂的柱系统。

③对样品有适宜的溶解度。否则样品会在柱头沉淀，不仅影响纯化分离，且会堵塞柱头。

④溶剂黏度要低。高黏度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压增加，分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。

⑤必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收或吸收很小。

⑥易于回收样品。应选用挥发性溶剂。

2.流动相的选择

在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力与它的极性相关。在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱。反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的溶剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相黏度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。乙腈与甲醇相比具有溶剂强度较高，黏度较小的优点，并可满足在紫外波长185～205nm处检测的要求，故乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。但乙腈的毒性比甲醇大。

3.流动相pH值

采用反相色谱法分离弱酸（3≤p Ka<7）或弱碱（7≤p Ka<8）样品时，通过调节流动相pH，可抑制样品组分的解离，改变组分在固定相上的保留时间。对于弱酸的分离，流动相的pH值越小（当pH值远远小于弱酸的p Ka值时），弱酸主要以分子形式存在。因此，分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，如采用50mmol/L磷酸盐缓冲液或1％乙酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液或30mmol/L三乙胺溶液。另外，流动相中加入有机胺可减轻或消除峰拖尾现象，所以有机胺（如三乙胺）又称为消尾剂或除尾剂。

4.流动相的脱气

HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度，基线的稳定性，甚至无法检测。常用的脱气方法有加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。

5.流动相的滤过

所有流动相所用溶剂在使用前都必须经0.22μm（或0.45μm）滤膜滤过，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也不例外。用滤膜过滤时，要注意区分有机相滤膜和水相滤膜。有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解。

6.流动相的贮存

流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂被污染，污染后的溶剂如用于HPLC系统，会污染色谱柱。另外，贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止空气溶入流动相。

磷酸盐、乙酸盐等缓冲液最好现配现用，不要贮存。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3d内使用，用前应重新滤过。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部沉淀的杂质和可能生长的微生物。

7.HPLC用水

HPLC要求使用超纯水，配制流动相要用新鲜制备的超纯水。通常可以通过以下几个方法制备：a.专门的纯水机或超纯水机，理想的HPLC用水应为18.2MΩ的超纯水，并通过0.22μm的滤膜，除去热源、有机物、无机离子等；b.去离子水重蒸；c.二次或三次重蒸水等。

附　岛津液相色谱仪（LC-Solution）操作规程

①打开电源，启动计算机。

②依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器电源。

③泵、自动进样器在线脱气。

④脱气完成后，打开LC-Solution工作站，采用梯度溶剂冲洗色谱柱，最好以20％的梯度下降冲洗至与流动相相同比例，每一梯度冲洗20～30倍柱体积。

⑤建立方法，保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果。

⑥正式进样分析前30min左右开启氘灯或钨灯，以延长灯的使用寿命。

⑦实验结束后，一般先用低浓度的甲醇水溶液冲洗整个流路30柱体积以上，再用甲醇冲洗至柱平衡即可。冲洗过程中关闭氘灯、钨灯。

⑧关机时，先退出LC-Solution工作站，再关闭泵、检测器等，然后关闭计算机。

⑨使用者必须认真填写使用登记本，出现问题及时报告，不能擅自拆卸仪器。

（俞　浩）

三、气相色谱法

气相色谱法（gas chromatography，GC）是英国生物化学家Martin等人在研究液液分配色谱的基础上，于1952年创立的一种极有效的分离方法，它是以气体作为流动相的一种色谱分析法，可用于分析和分离复杂的多组分混合物。气体黏度小，渗透性高，传质速率高，用气体作流动相，能获得很高的柱效，配以高灵敏度的检测器，能够实现多组分复杂混合物的分离和分析。

（一）概述

与其他方法相比，气相色谱法具有以下优点。

①应用范围广，能分析气体、液体和固体；

②灵敏度高，可测定痕量物质，可进行“mg”级的定量分析，进样量可在1mg以下；

③分析速度快，仅用几分钟至几十分钟就可完成一次分析，操作简单；

④选择性高，可分离性能相近物质和多组分混合物。

另外，还有操作稍有失误不会损伤仪器、试样分析费用低等特点。

只要在气相色谱仪允许的条件下可气化而不分解的物质，都可以用气相色谱法测定。对部分热不稳定物质或难以气化的物质，通过化学衍生化的方法，仍可用气相色谱法分析。目前由于使用了高效能的色谱柱，高灵敏度的检测器及微处理机，使得气相色谱法成为一种分析速度快、灵敏度高、应用范围广的分析方法。如气相色谱与质谱（GC-MS）联用、气相色谱与Fourier红外光谱（GC-FTIR）联用、气相色谱与原子发射光谱（GC-AES）联用等。

由于分析的样品在气相中进行，要求样品气化，因此不适用于大部分沸点高的热不稳定的化合物；反应活性较强的物质也难以进行分析，这些缺点使气相色谱的应用受到了一定的限制。

（二）气相色谱仪

气相色谱流程如图2-1所示，载气由高压气瓶供给，经减压阀减压，净化器净化，再经调节阀调到所需流速，得到稳定流量的载气。载气经气化室，将气化的样品带入色谱柱进行分离。分离后的各组分先后流入检测器，检测器按照一定的浓度或质量的变化转变为一定的电信号，经放大后在记录仪上记录下来，得到色谱流出的曲线。根据各峰的保留时间进行定性或者定量分析。

气相色谱仪由五大系统组成，如图2-2所示，分离系统是色谱仪的关键部分，分离后的组分能否产生信号取决于检测系统，中间的三个系统统称为温控系统，是色谱仪的核心。

1.气路系统

气相色谱的气路是一个载气连续运行的密闭管路系统，载气从钢瓶出来后依次经过减压阀、净化器、气流调节阀、流量计、气化室、色谱柱、检测器，放空。通过该系统，可以获得纯净的、流速稳定的载气，这是气相色谱分析的必备条件。

净化器是用来提高载气纯度的，它是一根用金属或高强度塑料制成的管子，串联在气路中，管里装有不同的净化剂，如活性炭、硅胶、分子筛等。载气流速的大小与稳定对分析结果有很大影响。在恒温色谱中，只要柱前压稳定，则载气流速稳定；在程序梯度升温时，载气流量发生变化，应该用稳流阀进行自动控制。载气流速的测定可用转子流量计或者皂膜流量计测量。

2.进样系统

进样系统包括两个部分：气化室和进样室。气化室是将样品瞬间气化为气体的装置，它是由一块金属块制成的，要求死体积小、容量大、内表面无催化活性，以保证样品迅速进入色谱柱。

进样装置一般有微量注射器和六通阀进样两种类型。微量注射器一般用于液体样品，各种规格均有。气体样品通常采用六通阀进样。近几年仪器都配备全自动进样装置，由计算机自动控制，取样、进样、复位、样品管路清洗等按预定程序自动进行，进样重复性高。

进样的样品分为气体、液体、固体，如果是气体则可采用顶空进样型气相色谱，如果是固体则可采用裂解气相色谱，液体则是一般常用的气相色谱。

3.分离系统

分离系统由色谱柱组成。常用的色谱柱有填充柱和毛细管柱两种。表2-2是两种不同类型的毛细管柱与一般的填充柱进行的比较。

填充柱管柱材质有不锈钢、玻璃、聚四氟乙烯等，形状有“U”形和螺旋形，柱内均匀、密实地填充固定相。其制备简单，种类多，柱容量大，分离效率较高，应用较为广泛。毛细管柱由石英和不锈钢拉制而成，柱内表面涂渍固定液，具有高效、快速、吸附及催化活性小等优点，缺点是制备工艺复杂。

4.温控系统

温度是气相色谱最重要的分离操作，它直接影响柱效、分离的选择性、检测的灵敏度和稳定性。气化室、色谱柱和检测器都需要加热控温，由于各部分的要求不一样，所以控温装置也不同，气化室温度一般最高，高于色谱柱恒温箱50～100℃，检测器和恒温箱温度相同或前者稍高后者，以防止分离后样品在检测器内冷凝。

5.检测记录系统

检测记录系统是指从色谱柱流出的组分，经过检测器转化为电信号，并经过放大由记录器显示。检测记录系统由检测器、信号转化器、信号放大器、记录器等组成。其中检测器是关键部分。

（三）气相色谱的固定相

气相色谱按固定相聚集态分为气固色谱和气液色谱两种，一般说来气相色谱为气液色谱。

1.气固色谱固定相

气固色谱法所遵循的规律是气体或蒸气在吸附剂上的吸附规律，气体在吸附剂表面上的吸附平衡可用“吸附等温线”描述。吸附等温线是在一定温度下气体或蒸气在吸附剂表面上的浓度随气体或蒸气在气相中的浓度而变化的规律。主要用于永久气体和低沸点烃类的分析。常用的固定相有各种形式的碳分子筛、无机分子筛、高分子多孔小球等。使用时，可根据其对气体的吸附能力的大小来选择最合适的吸附剂。

2.气液色谱固定相

气液色谱固定相由载体和固定液组成。载体是支撑固定液的惰性多孔固体，把固定液涂渍在载体上就成为气液色谱的固定相。

（1）载体（担体）　种类主要有硅藻土类载体、玻璃微球载体、氟塑料载体。硅藻土载体有白色载体和红色载体两种。白色载体在煅烧前加入了碳酸钠，煅烧时与铁形成了硅铁酸钠络合物，呈白色，我国生产的101型、405型和美国Chromosorb G载体为白色载体。红色载体是煅烧时部分矿物质变成了氧化物，其中铁以三氧化二铁存在，煅烧后呈红色，我国生产的6201型及美国的Chromosorb P载体为红色载体。

硅藻土载体在使用前要进行去活处理，如酸洗、碱洗、釉化、硅烷化及加减尾剂等。

（2）固定液　是色谱柱的核心，必须具备严格的条件：在工作温度下是液体，较低的蒸气压；较较高的热稳定性和化学稳定性；有好的浸渍能力，使固定液形成均匀的液膜；对所分离的混合物有选择性分离能力。

按照分子间作用力的大小对固定液进行了分类，分类情况如表2-3所示。

在选择固定液时要遵循几个原则：a.“相似相溶”原则，在同系物或相同官能团的混合物各组分在沸点上有差别时，使用该原则；b.根据固定液和被分离物分子之间特殊作用力，例如诱导力、氢键、受质子力、给质子力，形成超分子等；c.利用混合固定液；d.利用协同效应。实际工作中遇到的样品是比较复杂的，所以选择固定液是一个较困难的问题，一般依靠经验规律或参考文献，按最接近的性质选择。

（四）气相色谱检测器

气相色谱检测器检测组分的存在，并将组分的量定量地转换为电信号，加以放大。气相色谱检测器分为质量型和浓度型两种。浓度型检测器测量的是载气中某组分浓度瞬间的变化，即检测器的响应值和组分的浓度成正比。质量型检测器测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化，即检测器的响应值和单位时间内进入检测器某组分的量成正比。

常用的检测器有以下类型。

（1）热导检测器（TCD）

①原理：根据不同的物质具有不同的热导系数原理进行检测。

②热导池的结构：池体和热敏元件构成，池体内装有Wheatstone电桥。

③特点：TCD结构简单，性能稳定，通用性好，而且线性范围宽，价格便宜。缺点：灵敏度较低。

④适用范围：与载气导热率不同的可气化物质。

（2）氢火焰离子化检测器（FID）

①原理：以氢气和空气燃烧的火焰作为能源，利用含碳有机物在火焰中燃烧产生离子，在外加的电场作用下，使离子形成离子流，根据离子流产生的电信号强度，检测被色谱柱分离出的组分。

②结构：含碳有机化合物在氢火焰中燃烧产生正离子，收集这些离子并加以放大，得到代表组分的电流。

③影响因素：离子室的结构、操作条件、H2、载气、空气流速及纯度和温度影响灵敏度。

④特点：灵敏度很高，SFID=103STCD；检出限低，可达10-12g/s；死体积小，响应速度快，线性范围也宽，可达106；结构不复杂，操作简单。

⑤适用范围：大多数含碳有机化合物。不能检测永久性气体，如CO2、SO2、NOx、H2S、H2O。

（3）电子捕获检测器（ECD）

①适用范围：电负性物质（如含卤素、硫、磷、氰等）（检出限约10-14g/cm3）。农副产品、食品及环境中农药残留量的测定。

②缺点：线性范围窄，只有103左右，且响应易受操作条件的影响，重现性较差对大多数烃类没有响应。

（4）火焰光度检测器（FPD）　适用于含磷硫有机化合物，检出限：10-12g/s（P）或10-11g/s（S）。

（五）操作条件的选择

在气相分析中，为了得到好的分析结果，除了选择固定相之外还要考虑温度、载气流速等因素。

1.载气流速的选择

通常使用的载气有N2、H2、Ar、He等气体。选用何种载气，根据具体情况分析，如果是降低纵向扩散，用N2、Ar重载气；如果是降低气相的传质阻力缩短分析时间的话用H2等轻载气。对于TCD和FID检测时多用轻载气。FID要使用三种气体（N2、H2、空气），其流速一般为：N2流速:H2流速=1:1，空气的流量大于H2的5～10倍。

2.柱温的选择

柱温是气相中的很重要的参数，对峰高影响较大，对峰面积没什么影响。通常是通过实验来选择柱温，既达到各物质分离又峰形良好不拖尾。柱温还不能高于固定液的最高使用温度，否则固定液流失，不利于分离。

3.气化室、检测器的温度

气化室的温度要高于样品的沸点，一般是最高的，高于色谱柱恒温箱50～100℃。

FID检测器的温度高于100℃，防止水蒸气冷凝。其他的检测器温度要视具体情况来分析。

（六）毛细管气相色谱法简介

1.毛细管柱的特征和类型

毛细管气相色谱法（CGC）是采用高分离效能的毛细管分离复杂组分的一种气相色谱法。其分为开管型和填充型两大类。填充型应用相对很少。开管型分为：常规型（壁涂型WCOT和多孔层型SCOT）、小内径型、大内径型、集束型等。

2.毛细管柱气相色谱系统

现代实验用气相色谱仪大都既现可作填充柱型又可作毛细管型。二者在进样系统上有差别，毛细管型在柱前多了一个分流或不分流的进样器，柱后加了尾吹气路。毛细管柱样品容量小，大的样品量会超负荷，所以采用分流。由于毛细管柱载气流速很小，进入检测器后发生突然减速，引起色谱峰扩张，所以增加辅助尾吹，以加速样品通过检测器。

常用的检测器为FID，其他类型的较少用。

（七）气相色谱法的应用

气相色谱法具有的优点使其在石油、化工、医药、卫生、环境监测、生物化学等领域都得到了应用。

在卫生检验中的应用：空气、水中污染物如挥发性有机物、多环芳烃［苯、甲苯、苯并（a）芘］等；农作物中残留有机氯、有机磷农药等；食品添加剂苯甲酸等在医学检验中的应用：体液和组织等生物材料的分析，如脂肪酸、甘油三酯、维生素、糖类等。在药物分析中的应用：抗癫痫药、中成药中挥发性成分、生物碱类药品的测定等。

目前，气相色谱与质谱（GC-MS）联用、气相色谱与傅里叶（Fourier）红外光谱（GC-FTIR）联用、气相色谱与原子发射光谱（GC-AES）联用等，使得其应用更为广泛。

附1　GC9890气相色谱仪（南京南达分析仪器）操作步骤简介

1.开机过程

①打开氮气、氢气、空气开关；

②色谱仪侧面压力表应有指示（氮气压力表指针为0.3MPa，氢气压力表为0.1MPa，空气压力表为0.15MPa）；

③色谱仪正面气路框压力表亦有指示；

④打开气相色谱仪电路框侧面的电源开关（打开，开关灯亮）；

⑤色谱仪经过内部电路自检后（约20s），显示屏上将显示“PASSEDSELFTEST”并且红灯亮而不闪；

⑥按信号1键，应显示“SIGNAL”“1”“A”，继续按信号1键应显示通道A的数值，如“SIGNAL”“1”“0.0”（注意此时数值一定要小于0.9，否则不能点火）注“1”；

⑦按检测器A温度使其温度大于120℃，方可点火；

⑧点火过程：将气路框上指示为氢气的旋钮以顺时针方向开大（以火着为准），用点火枪放在检测器FID的烟囱上连续点火，直到显示屏上基流由0.0增大到某一数值为止；

⑨此时火焰较大，将氢气旋钮以逆时针方向开小到所需要的值（20～80）；

⑩这时可以把外接信号的按钮开关打开（按钮按下），接通外界工作站。

2.关机过程

①将氢气钢瓶和空气钢瓶的阀门开关（或氢气发生器和空气的电源开关）关掉；

②色谱仪显示屏上基流逐渐下降到“0.0”；

③将炉温下降到60℃以下；

④把外接信号的按钮开关关掉，与工作站断开；

⑤关掉色谱仪的电源开关；

⑥最后关闭载气（氮气）气源。

附2　气相色谱使用注意事项

1.载气钢瓶的使用规程

①钢瓶必须分类保管，直立而定，远离热源，避免暴晒及强烈振动，氢气室内存放量不得超过2瓶。

②氧气瓶及专用工具严禁与油类接触。

③钢瓶上的氧气表要专用，安装时螺扣要上紧。

④操作时严禁敲打，发现漏气须立即修好。

⑤用后气瓶的剩余残压不应少于980k Pa。

⑥氢气压力表系反螺纹，安装拆卸时应注意防止损坏螺纹。

2.减压阀的使用及注意事项

①在气相色谱分析中，钢瓶供气压力在9.8～14.7MPa。

②减压阀与钢瓶配套使用，不同气体钢瓶所用的减压阀是不同的。氢气减压阀接头为反向螺纹，安装时需小心。使用时需缓慢调节手轮，使用完毕必须旋松调节手轮和关闭钢瓶阀门。

③关闭气源时，先关闭减压阀，后关闭钢瓶阀门，再开启减压阀，排出减压阀内气体，最后松开调节螺杆。

3.微量注射器的使用及注意事项

①微量注射器是易碎器械，使用时应多加小心，不用时要洗净放入盒内，不要随便玩弄，来回空抽，否则会严重磨损，破坏气密性，降低准确度。

②微量注射器在使用前后都须用丙酮等溶剂清洗。

③对10～100μL的注射器，如遇针尖堵塞，宜用直径为0.1mm的细钢丝耐心穿通，不能用火烧的方法。

④硅橡胶垫在几十次进样后，容易漏气，需及时更换。

⑤用微量注射器取液体试样，应先用少量试样洗涤多次，再慢慢抽入试样，并稍多于需要量。如内有气泡则将针头朝上，使气泡上升排出，再将过量的试样排出，用滤纸吸去针尖外所沾试样。注意切勿使针头内的试样流失。

⑥取好样后应立即进样，进样时，注射器应与进样口垂直，针尖刺穿硅橡胶垫圈，插到底后迅速注入试样，完成后立即拔出注射器，整个动作应进行得稳当、连贯、迅速。针尖在进样器中的位置、插入速度、停留时间和拔出速度等都会影响进样的重复性，操作时应注意。

4.热导池检测器的使用及注意事项

①开启热导电源前，必须先通载气，实验结束时，把桥电流调到最小值，再关闭热导电源，最后关闭载气。

②稳压阀，针形阀的调节须缓慢进行。稳压阀不工作时，必须放松调节手柄。针形阀不工作时，应将阀门处于“开”的状态。

③各室升温要缓慢，防止超温。

④更换气化室密封垫片时，应将热导电源关闭。若流量计浮子突然下落到底，也应首先关闭该电源。

⑤桥电流不得超过允许值。

5.氢火焰检测器的使用及注意事项

①通氢气后，待管道中残余气体排出后，应及时点火，并保证火焰是点着的。

②使用FID时，离子室外罩须罩住，以保证良好的屏蔽和防止空气侵入。如果离子室积水，可将端盖取下，待离子室温度较高时再盖上。工作状态下，取下检测器罩盖，不能触及极化极，以防触电。

③离子室温度应大于100℃，待层析室温度稳定后再点火，否则离子室易积水，影响电极绝缘而使基线不稳。

（王海侠）